[发明专利]用于检测核酸序列变体的方法

说明书

本发明提供用于检测靶区内是否存在核酸变体的方法。这些方法包括在选择子阻断剂(selector blocker)的存在下用正向引物和反向引物扩增所述靶区。所述选择子阻断剂包括在没有所述核酸变体时与所述靶区互补的序列。所述方法还包括检测所述靶区的扩增，此处所述靶区的扩增指示所述靶区中的所述核酸变体的存在。所述核酸变体可包括缺失、突变或插入。

本申请是申请号为201280032293.0，发明名称为“用于检测核酸序列变体的方法”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及用于检测靶核酸序列中核酸变体的方法和用于高保真序列扩增的方法。

背景

核酸变体的检测对多种情况而言是重要的，其对疾病的检测和预后极其重要。目前，就检测核酸变体而言有广泛的试验形式。此类试验包括焦磷酸解作用激活的聚合(PAP)、使用LNA阻断剂的试验和cast-PCR试验。

焦磷酸解激活的聚合反应(PAP)可用于检测突变负荷或检测微小残留病。在PAP中，焦磷酸解和DNA聚合酶的聚合反应可通过使用焦磷酸解可激活的寡核苷酸(P*)来有序偶合。所激活的P*可通过DNA聚合作用来延伸。该试验的特异性由焦磷酸解作用和聚合作用共同产生，因为显著的非特异性扩增需要错配焦磷酸解和由DNA聚合酶的错误掺入相结合，而这是极端罕见的事件。(参见，例如，Liu和Sommer,“Pyrophosphorolysis-activatedpolymerization(PAP):application to allele-specific amplification(焦磷酸解激活的聚合反应(PAP)：在等位基因特异性扩增中的应用),”Biotechniques,29(5):1072-6,1078,1080(2000)；通过引用全文纳入本文)。

LNA阻断剂也可用在检测和/或定量核酸群中核酸变体的方法中，所述核酸群中野生型核酸丰度较高。这类方法使用高亲和力的短寡核苷酸，所述寡核苷酸靶向野生型而不是少数或突变序列，并起到阻断野生型DNA检测的功能。所述LNA阻断剂探针可与较长的检测探针或PCR引物联用以扩增和/或鉴定所述少数或突变序列。(参见，例如，美国专利申请号20100009355；其通过引用全文纳入本文)。

Cast-PCR也可用作分析不同等位基因之间序列变异的试验。所述方法使用竞争性等位基因特异性TaqMan PCR(“cast-PCR”)来区分核酸变体。Cast-PCR采取在靶核酸序列上进行两个扩增反应。第一反应包括在第一等位基因特异性引物和第一等位基因特异性阻断剂存在下扩增，然后检测扩增产物，所述第一等位基因特异性阻断剂与所述第一等位基因变体互补。第二反应包括在第二等位基因特异性引物和第二等位基因特异性阻断剂存在下扩增，然后检测扩增产物，所述第二等位基因特异性阻断剂与所述第二等位基因变体互补。(参见，例如，美国专利申请号20100221717；其通过引用全文纳入本文)。

上述方法全部都具有不同的难点和局限。用于检测罕见变体的这些方法背后的一个共同问题是酶保真度欠佳。不易区分在复制和相关扩增过程中引入的误差和真实的罕见变体与突变，从而削弱了这些方法的性能。此外，在等位基因特异性引发的情形，例如扩增阻碍突变系统(ARMS,Nucleic Acids Res.17:2503-16(1989))中，扩增中的错误引发会“覆写(over-write)”变体位点并导致欠佳结果。在大多数情况中，上述方法的特异性局限于0.1～5％的等位基因普遍性。甚至在下一代测序方法中也有这种情况，因为使用的聚合酶所引入的差错足以将罕见等位基因检测的灵敏度限制到约3～5％。所有这些试验的关键难题在于，它们的核心是使用DNA聚合酶的扩增方法，这些方法因为失真而引入差错，造成固有背景在1～3％范围或更大，这取决于聚合酶。有少许方法能够获得高得多的特异性水平，例如数码PCR，但是这些方法复杂、昂贵，并且不易于和确证试验或诊断试验交互。并且，数码PCR自身还不适于高度多路复用。