[发明专利]一种胎鼠内皮祖细胞的提取分离培养方法

说明书

本发明公开了一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的分离培养方法，包括将孕鼠的受孕子宫放入青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中浸泡，取出胎鼠放入度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，洗涤；取出肺组织放入PBS并破碎，用0.25％胰酶消化步骤以上中的破碎组织，用含10％FBS的DMEM培养基培养，离心分离，取其沉淀，用含生长因子和2％FBS的血清的EBM‑2培养基悬起，以10⁶/ML细胞浓度接种于6孔板中，置于恒温培养箱中培养，当原代细胞生长融合达80‑90％时，用0.25％的胰酶消化传代培养，直至细胞呈现均一形态，完成培养。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种内皮祖细胞提取分离培养方法，特别是涉及一种来源为胎鼠的内皮祖细胞的提取、分离和培养方法。

背景技术

内皮祖细胞(ENDOTHELIAL PROGENITOR CELLS，简称“EPCS”)是血管内皮前体细胞，能定向分化为成熟的内皮细胞，亦称血管母细胞。机体缺血时，EPCS可从骨髓中动员进入外周血，到达缺血组织参与血管新生。把体外培养和扩增的EPCS输入体内，提高循环中EPCS的数量和质量，可促进缺血部位的血管新生。因此，EPCS移植成为了治疗缺血性血管疾病的一条新思路。

对于内皮祖细胞的提取，文献报道的主要是采集脐带血或出生后不同年龄的动物骨髓、外周血，通过密度梯度离心法获取单个核细胞，然后接种于特殊物质包被的培养瓶或培养皿中进行体外诱导培养。

内皮祖细胞临床应用的关键是探寻其理想的组织来源，但内皮祖细胞募集、分离和培养的方法存在较大差异，并且得到的内皮祖细胞数量少、扩增效率及细胞增殖较慢。而本发明采取新的来源途径提取内皮祖细胞，即采用胎鼠的肺组织为组织来源，为内皮祖细胞的提取分离、培养提供了一种新的切实可行的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取分离培养方法，本发明的方法采用胎鼠的肺组织为内皮祖细胞的新来源，经提取、分离、培养获得内皮祖细胞。

本发明一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取、分离培养方法，包括以下步骤：

(1)取胎鼠的肺脏，放入含有500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中，并将肺组织破碎；

(2)用胰酶消化步骤(1)中的破碎组织；

(3)消化完后，用含FBS的DMEM培养基培养15-18H；

(4)然后取出非贴壁的细胞，离心，取其沉淀；

(5)将步骤(4)的沉淀用含生长因子和FBS的血清的EBM-2培养基悬起，以浓度接种于孔板中，置于恒温培养箱中培养；

(6)每2-4天换一次液，当原代细胞生长融合达80-90％时，用胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态即完成培养。

上述本发明的方法，所述胎鼠，其获得的方法包括：(1)将孕鼠麻醉后取出串珠样受孕子宫，放入含有500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中浸泡；(2)将浸泡后的受孕子宫分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织后，胎鼠放入含有500U-1000U高强度青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，洗涤后得到胎鼠。

在具体实施方案中，本发明的一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的提取分离培养方法通过以下实施方案实现，包括以下步骤：

(1)将孕鼠麻醉后取出取出串珠样受孕子宫，放入含有500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷PBS中浸泡；

(2)将浸泡后的受孕子宫分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织后，胎鼠放入含有各500U-1000U的青霉素和链霉素双抗的预冷PBS的平皿中，洗涤；