[发明专利]一种胎鼠内皮祖细胞的提取分离培养方法

权利要求书

1.一种胎鼠肺来源内皮祖细胞的分离培养方法，包括以下步骤：

（1）取胎鼠的肺脏，放入含有 500U-1000U青霉素和链霉素双抗的预冷 PBS 中，并将肺组织破碎；

（2）用胰酶消化步骤（1）中的破碎组织；

（3）消化完后，用含FBS的DMEM培养基培养15-18小时；

（4）然后取出非贴壁的细胞，离心，取其沉淀；

（5）将步骤（4）的沉淀用含生长因子和FBS的血清的EBM-2培养基悬起，接种于孔板中，置于恒温培养箱中培养；

（6）每2-4 天换一次液，当原代细胞生长融合达 80-90% 时，用胰酶消化传代培养，持续传代直至细胞呈现均一形态即完成培养；

其中，所述胎鼠获得包括：

（A）将孕鼠麻醉后取出串珠样受孕子宫，放入含有 500U-1000U 青霉素和链霉素双抗的预冷 PBS 中浸泡；

（B）将浸泡后的受孕子宫分离出连接胎鼠肚脐与胎盘的脐带组织后，胎鼠放入含有500U-1000U 高强度青霉素和链霉素双抗的预冷 PBS 的平皿中，洗涤后得到胎鼠。

2.如权利要求1所述的方法，步骤（2）中所述洗涤，其洗涤次数为2次。

3.如权利要求1的方法，步骤（2）中所述的胰酶为0.25%胰酶，步骤（3）中DMEM培养基含10%FBS，培养时间为16小时。

4.如权利要求1所述的方法，步骤（4）中所述离心为1000rpm，5min，步骤（5）中的EBM-2培养基含有2% FBS。

5.如权利要求1所述的方法，步骤（5）的接种，细胞浓度为10⁶/ml，恒温箱内含有5%CO₂、温度为37℃，步骤（6）中每3天换一次液，胰酶的浓度为0.25%。

6.如权利要求1所述的方法，步骤（2）中所述胰酶消化是采用分步消化法，每步均置于37℃细胞培养箱中孵育10min，直至组织完全消化。

7.如权利要求1所述的方法，步骤（A）中所述浸泡，浸泡时间为3-5分钟。

8.如权利要求1所述的方法，步骤（A）中所述孕鼠为孕龄为15-19天的孕鼠。

9.如权利要求1所述的方法，步骤（1）中所述破碎组织，破碎后的组织大小为 0.5-1.0mm³。