[发明专利]一种新的A/T到G/C碱基定点转换的基因编辑系统

说明书

本发明提供了一种新的A/T到G/C碱基定点转换的基因编辑系统，具体地，本发明提供了一种在细胞内进行基因定点替换的方法，本发明的方法可高效可识别特定的PAM，并特定的位置实现单个碱基A/T到G/C基因组的高效的定点替换。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种新的A/T到G/C碱基定点转换的基因编辑系统。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，正改变着传统的基因操作手段。

目前，基于胞嘧啶脱氨酶与CRISPR/Cas9融合而成的单碱基基因编辑技术(baseeditor,BE)在基因组上实现单个碱基C/G到T/A基因组定点编辑,已被报道可用于高效地进行基因组的基因突变或修复，疾病动物模型制作，基因治疗,基因功能筛选等。最近，新报道的基因基于腺苷脱氨酶与CRISPR/Cas9融合而成的新的单碱基基因编辑技术(adeninebase editor,ABE)(图1)也可在基因组上实现单个碱基A/T到G/C基因组定点编辑，进一步丰富了单碱基基因组编辑技术的工具箱。但目前报导的ABE系统是基于spCas9改造而来，仅识别NGG为PAM的靶点，因此其靶点在基因组上的覆盖度较低，极大的限制了ABE系统应用范围。

因此，本领域迫切需要开发一种可识别其它类型PAM，并且具有不引入DSB，indels及脱靶效应极低、更加安全高效的优点的单个碱基A/T到G/C基因组定点编辑编辑系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可识别其它类型PAM，并且具有不引入DSB，indels及脱靶效应极低、更加安全高效的优点的单个碱基A/T到G/C基因组定点编辑编辑系统。

本发明第一方面提供了一种在细胞内进行基因定点替换的方法，包括步骤：

(i)提供一细胞以及第一载体和第二载体，其中所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有表达sgRNA的表达盒，

其中，所述第一核苷酸具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：

P1-X1-L1-X2-X3(I)；

其中，P1为第一启动子序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

L1为无或连接序列；

X2为突变型Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；

X3为polyA序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

所述表达sgRNA的表达盒中的sgRNA为NGAN型sgRNA或NNNRRT型sgRNA，并且所述sgRNA的第7、8和/或9位对应于预定发生高效A→G定点突变的位置(即为A)；

(ii)用所述的第一载体和第二载体感染所述的细胞，从而在所述细胞内进行基因定点替换。

在另一优选例中，所述第一载体和/或第二载体还含有表达筛选标记的表达盒。

在另一优选例中，所述第一载体、第二载体可以相同，可以不同。

在另一优选例中，所述第一载体和第二载体可以为同一载体。

在另一优选例中，所述筛选标记选自下组：绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其组合。

在另一优选例中，所述的方法是非诊断和非治疗性。

在另一优选例中，所述的细胞来自以下物种：人、非人哺乳动物、家禽、植物。