[发明专利]一种新的A/T到G/C碱基定点转换的基因编辑系统

权利要求书

1.一种在细胞内进行基因定点替换的方法，其特征在于，包括步骤：

(i) 提供一细胞以及第一载体和第二载体，其中所述第一载体含有第一核酸构建物，所述第二载体含有表达sgRNA的表达盒，

其中，所述第一核苷酸具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：

P1-X1-L1-X2-X3 (I)；

其中，P1为第一启动子序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

L1为无或连接序列；

X2为突变型Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；所述Cas9核酸酶为含有突变位点D10A, E782K, N968K, R1015H 的saCas9n；

X3为polyA序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

所述表达sgRNA的表达盒中的sgRNA为NNNRRT型sgRNA，并且所述sgRNA的第7、8和/或9位对应于预定发生高效A→G定点突变的位置，即为A；所述X2元件靶向的PAM序列为N₁N₂N₃RRT，即N₁, N₂=A,T,C或G；N₃=A, T, C或G；R=A或G；

(ii) 用所述的第一载体和第二载体感染所述的细胞，从而在所述细胞内进行基因定点替换。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一载体和/或第二载体还含有表达筛选标记的表达盒。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述筛选标记选自下组：绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、或其组合。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述sgRNA的第8和/或9位对应于预定发生高效地A→G定点突变的位置，即为A。

5.一种核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物具有5’-3’(5’至3’)的式I结构：

P1-X1-L1-X2-X3 (I)；

其中，P1为第一启动子序列；

X1为腺嘌呤脱氨酶的编码序列；

L1为无或连接序列；

X2为突变型Cas9核酸酶的编码序列，所述的Cas9核酸酶是无切割活性或单链切割活性的；所述Cas9核酸酶为含有突变位点D10A, E782K, N968K, R1015H的saCas9n；

X3为polyA序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；所述X2元件靶向的PAM序列为N₁N₂N₃RRT，即N₁, N₂=A,T,C或G；N₃=A, T, C或G；R=A或G。

6.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述的第一启动子选自下组： CMV启动子、CAG启动子、PGK启动子、或其组合。

7.如权利要求5所述的核酸构建物，其特征在于，所述腺嘌呤脱氨酶为串联型腺嘌呤脱氨酶，所述串联型腺嘌呤脱氨酶结构如式II所示：

Z1-L2-Z2 (II)

其中，

Z1为野生型腺嘌呤脱氨酶TadA的氨基酸序列；

L2为任选的连接肽序列；

Z2为突变型腺嘌呤脱氨酶TadA*的氨基酸序列。

8.一种载体组合，其特征在于，包括第一载体和任选的第二载体，所述第一载体含有权利要求5所述的核酸构建物，所述第二载体含有表达sgRNA的表达盒，所述表达sgRNA的表达盒中的sgRNA为NNNRRT型sgRNA，并且所述sgRNA的第7、8和/或9位对应于预定发生高效A→G定点突变的位置，即为A。

9.如权利要求8所述的载体组合，其特征在于，所述第一载体和/或第二载体还整合有筛选标记。