[发明专利]去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法

权利要求书

1.去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，包括脱胶、丝素溶液制备、丝素蛋白酶解、凝胶柱层析、离子交换树脂层析、高效液相色谱纯化，其特征在于：所述丝素蛋白酶解步骤为：丝素溶液中加入碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和左旋维生素C，酶解，灭酶，冷却后离心，上清液浓缩，即为功能肽粗液，备用。

2.根据权利要求1所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶的加酶量为600-700U/g和300-400U/g，所述酶解pH为8-9、温度为50-60℃、时间为3-4h。

3.根据权利要求1所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述左旋维生素C的添加量为碱性蛋白酶重量的3-5%。

4.根据权利要求1所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述脱胶步骤为：将蚕茧壳按料液比为1:30-40（g/mL）加入浓度为0.3-0.7%的碳酸钠溶液中，脱胶30-40min，然后用蒸馏水将脱胶的蚕茧壳清洗干净，在70-90℃下烘干，即得脱胶蚕茧壳。

5.根据权利要求1所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述丝素溶液制备步骤为：将脱胶蚕茧壳加入浓度为8-12%的氯化钙溶液中，在95-100℃下盐溶2-5min，冷却后调节丝素溶液浓度为40-60g/L，备用。

6.根据权利要求1所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述凝胶柱层析制备步骤为：将葡聚糖凝胶用去离子水在沸水浴中加热溶胶1-3h，然后与去离子水按照重量比为2.5-3.5:1混合均匀，然后灌入柱子中，填装好的凝胶柱经平衡后，将功能肽粗液上样至柱子内进行层析分离，用双蒸水进行洗脱，设置检测器灵敏度为0.2A，检测器调至280nm处检测，进样量1.8-2.2mL，流速为0.5-0.8mL/min，根据280nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冷冻干燥，备用。

7.根据权利要求6所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述葡聚糖凝胶为改性葡聚糖凝胶，所述葡聚糖凝胶的改性方法为：将葡聚糖凝胶中加入NaIO₄和2,6-二氯苯甲酸，再加入H₂O₂溶液，反应，冷却，用去离子水洗净，抽滤，干燥，得到改性葡聚糖凝胶。

8.根据权利要求7所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述葡聚糖凝胶、NaIO₄和2,6-二氯苯甲酸的摩尔比为1:0.8-1.2:0.013-0.016。

9.根据权利要求1所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述离子交换树脂层析步骤为：将凝胶柱层析步骤得样品用双蒸水配成浓度为45-55mg/mL的溶液，然后在温度为1-5℃、转速为10000-13000rpm的离心机中离心5-10min，去除不溶性杂质，上清液加入到DEAE-52阴离子交换树脂层析柱，依次用双蒸水、0.1、0.5和1M的NaCl溶液洗脱，收集去黑色素最强组分，即为离子交换层析酶解物。

10. 根据权利要求1所述的去除皮肤中黑色素的功能肽的制备方法，其特征在于：所述高效液相色谱纯化步骤为：将上述凝胶层析酶解物用双蒸水配成80-100μg/mL的溶液，利用高效液相色谱进行纯化，即得功能肽，色谱条件为：设置进样量为4-6μL、色谱柱为AgilentC₁₈（250mm×4.6mm，5μm）、柱温为25-35℃、流动相为10-15%乙腈溶液、洗脱速度为0.8-1.2mL/min。