[发明专利]一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒

说明书

本发明涉及一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒，属于病原微生物体外分子检测技术领域。本发明提供了一种基于荧光PCR法同时检测三种曲霉的引物探针组合，所述曲霉包括烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示序列的5’端修饰有荧光基团、3’端修饰有荧光猝灭基团的物质。本发明提供的引物探针组合能够实现烟曲霉、黄曲霉和黑曲霉的同时检测，检测特异型强，灵敏度高。

技术领域

本发明涉及病原微生物体外分子检测技术领域，具体涉及一种同时检测三种曲霉的引物探针组合和荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

深部真菌病是指致病真菌不仅侵犯皮肤、黏膜而且侵犯深入部组织和内脏所致的疾病。真菌广泛分布于自然界，某些真菌可以感染人体而致病。深部真菌病常为继发感染，多在糖尿病、血液病、恶性肿瘤、大面积烧伤、严重营养不良或其他慢性消耗性疾病的基础上发病。或长期应用抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、使机体内菌群失调或抑制了机体的免疫反应而诱发。

曲霉属于条件致病菌，广泛存在于生活环境中，其分生孢子微小，可随呼吸进入机体，以纤维蛋白、层连蛋白、血纤维蛋白原等为中介，黏附于宿主组织细胞，萌发菌丝，进而致病。曲霉菌病是由致病曲霉菌所引起的疾病。致病曲霉菌主要经呼吸道侵犯肺部，也可侵犯皮肤、黏膜。严重者可发生败血症，使其他组织和系统受累。常见的病原菌有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉等，其中烟曲霉是最常见的病原菌，当免疫功能受抑制或损伤时易受感染。

目前实验室对于曲霉的检测主要有以下四种：

(1)病原体培养鉴定检测法

取自患处的标本作直接涂片或培养，涂片可见菌丝或曲霉菌孢子，培养见曲霉菌生长。曲霉菌是实验室常见的污染菌，必须反复涂片或培养，多次阳性且为同一菌种才有诊断价值。虽然培养鉴定法是临床最常采用的方法，但是其培养周期较长。

(2)病理组织检查

取受损组织或淋巴结活检，可根据真菌形态确诊。尤其对播散性曲霉菌，可及时作出诊断。病理组织检查的结果较为可靠，但是由于其具有创性，多数患者难以接受，限制了其应用。

(3)免疫学检测法

检测血清中烟曲霉IgM和IgG抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)，曲霉菌抗原检测方法主要有1,3-β-D葡聚糖检测(G试验)和半乳甘露聚糖检测(GM试验)。1,3-β-D葡聚糖抗原是除结核菌和隐球菌外所有真菌特有的一种细胞壁成分，以血清为检测样本。半乳甘露聚糖是存在于曲霉菌细胞壁中的一类具有高度特异性和高度保守型的多糖，可作为曲霉菌检测的特异性分子标志物，酶联免疫吸附试验(ELISA)是较为常见的半乳甘露聚糖抗原检测方法，但是该方法灵敏度不高，不能够区分不同的菌种，常常发生假阳性或假阴性。

(4)实时荧光聚合酶链反应法(Real-Time Fluorescence Polymerase ChainReaction，荧光PCR)