[发明专利]一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒

说明书

本发明涉及一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，包括如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.64所示的膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物和接头元件。本发明的试剂盒能够通过尿液核酸同时扩增多个膀胱癌突变基因位点构建测序文库，通过高通量测序以及生物信息分析受检者患膀胱癌的风险，采样方便，准确性高，且为无创式，减轻了病人痛苦。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，更具体的，涉及一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒。

背景技术

膀胱癌是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，膀胱内窥镜检查被视为膀胱癌诊断的金标准，但膀胱内窥镜检查会带来许多负面影响，如尿液路感染、尿液道损伤、膀胱损伤。尿液脱落细胞学检查是另一种用于诊断膀胱癌的常规方法，其优点是无创伤，特异性高、非侵入性，克服了膀胱内窥镜检查的缺点，但其检出率受到多种因素的影响，尿液脱落细胞学检测膀胱癌的敏感性为13%～75%，特异性为85%～100%，敏感性与肿瘤细胞分级密切相关。FISH 技术可以诊断膀胱肿瘤的有效方法，有助于术后监测及评估复发危险性。2016年，屈志义等研究显示FISH检测的阳性率和敏感度分别为77.0%和82.02%， FISH检测的敏感性和总阳性率略微高于尿脱落细胞检测，但是特异性上的差异无统计学意义。因此，有必要寻求一种无创、高灵敏性、高准确性的膀胱癌肿瘤标志物检测方法。

随着二代测序技术的不断发展和成本的大幅度降低，基因检测在膀胱方面的应用越来越来越广，膀胱癌由于其发病灶的特殊性，目前正在使用或研究的大多数非侵入性膀胱癌检测都依赖于从尿液细胞中提取出的DNA，联合检查DNA体细胞突变和相关基因的甲基化变化情况，2016年，Dahmcke等在尿液中检测到TERT（C228T，C250T），FGFR3的突变位点（p.R248C，p.S249C，p.G370C，p.Y373C）以及部分基因的甲基化异常(SALL3，ONECUT2，CCNA1，BCL2，EOMES， VIM)，该结果显示其敏感性为97.0%，特异性为69%；2017年，van等通过尿液中FGFR3， TERT ，HRA S，OTX 1，ONECUT2，TWIST1 等基因突变和甲基化研究，综合诊断其敏感性和特异性分别为93%和86%，但是依然缺乏一种能从单一维度检测就能体系出较高特异性和敏感性的方法。

膀胱镜检查和活检是膀胱癌诊断的金标准，其敏感性约为90~97%。但该方法属有创检查，可导致尿路感染、尿道膀胱损伤等并发症，费用较高且对于微小肿瘤容易漏诊。

尿液脱落细胞学检查是一种膀胱癌无创诊断方法，虽有较高的特异性，但敏感性低（13%～75%），尤其对低级别肿瘤的敏感性更低。

其它无创诊断方法如荧光原位杂交（FISH）、尿核基质蛋白22（Nuclear matrixprotein 22, NMP22）、膀胱肿瘤抗原(bladder tumor antigen, BTA)等，敏感性虽较尿液脱落细胞学检查稍有提高（70~80%），对分期低(Ta、T1)，低级别的肿瘤敏感性更低，同时特异性降低，均未达到临床需求的理想水平。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，通过对尿液核酸的DNA超低频的体细胞突变信息建立生物信息模型来分析受检者患膀胱癌的风险性，提供一种无创、高效、特异性和灵敏度高的膀胱癌检测试剂盒。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种基于高通量测序技术检测膀胱癌的试剂盒，包括膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物和接头元件，所述膀胱癌突变基因多重PCR特异性引物包括上游特异性引物组1和上游特异性引物组2，用于对待测样品中多个目标区域进行扩增，所述上游特异性引物组1的核酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.32所示所示，所述上游特异性引物2的核酸序列如SEQ ID NO.33-SEQ ID NO.64所示,所述接头元件用于与待测样品核酸片段连接构建高通量测序文库。

进一步，所述试剂盒还包括接头元件通用引物、酶混合物、质控品和无核酸酶水。