[发明专利]一种胡杨叶片高频诱导再生植株的方法

说明书

本发明涉及一种胡杨叶片高频诱导再生植株的方法，属于胡杨叶片再生方法技术领域。本发明通过对基础培养基及培养条件的优化，克服以往胡杨传代三代以上就发生叶片黄化、难以再生的现象。本发明在改良组培苗培育条件的基础上，以叶片为外植体，经过不定芽诱导、继代培养、壮苗培养、生根培养等技术环节，最终建立了胡杨叶片高效再生诱导再生植株的方法体系。利用本方法能够实现胡杨离体叶片的高效再生，具有重现性好、生产效率高等优点，不定芽再生率可达98％以上，有效克服了胡杨在自然条件下实生繁殖困难，实现了离体快繁，并为实现胡杨的遗传转化及种植资源改良奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种胡杨叶片高频诱导再生植株的方法，属于胡杨叶片再生方法技术领域。

背景技术

胡杨(Populus euphratic Oliver)具有极强的抗干旱、耐盐碱能力,是在我国西北荒漠、戈壁地区唯一能形成森林的乔木树种，对防风固沙、维持生态平衡起到重要的作用。另外，胡杨树型优美，可以作为优良的行道树和庭园树；其木材木质坚硬，是上等建筑和家具用材。更为重要的是，胡杨被认为是研究木本植物耐盐、抗旱机制的模式树种，已成为树木耐盐机制及抗逆基因工程育种方面的研究热点。2013年，由兰州大学、深圳华大基因研究院和中国科学院青岛生物能源与过程研究所等单位共同完成的胡杨全基因组测序工作，为探索胡杨内在的分子作用机制提供了更为广阔的空间。

要深入研究胡杨耐受干旱、高盐胁迫的分子机制并对其进行改良，遗传转化是重要手段，而植物转基因最有效的农杆菌介导的叶盘转化法遇到的最大的瓶颈和障碍就是叶片再生体系的建立，很多植物材料因为没有建立高效稳定的叶片再生及转化体系而导致遗传转化无法实施。

目前，国内外学者一直致力于胡杨试管苗的组织培养工作，已初步实现了胡杨的离体培养，但在培养过程中遇到了试管苗黄化、玻璃化等问题无法解决，叶片再生体系则更难实现，因此，长期以来对胡杨遗传转化方面的研究一直是空白。

发明内容

本发明针对目前胡杨离体再生技术的不足，提供一种以胡杨叶片为外植体的高效离体再生方法，为胡杨规模化快速生产提供技术，同时为胡杨基因工程育种打下基础，对开展胡杨分子机理研究及种质资源改良工作具有重要意义。

一种胡杨叶片高频诱导再生植株的方法，其特殊之处在于包括以下步骤：

1)、外植体的获得

取带腋芽的胡杨茎段作为外植体，先用洗洁精浸泡，再依次进行自来水冲洗、无菌水冲洗、75％乙醇浸泡、无菌水冲洗、0.1～0.2％升汞消毒、无菌水清洗，最后用无菌吸水纸吸去表面水分，切段得带腋芽的胡杨茎段；

所述步骤1)的具体处理步骤为：取带腋芽的胡杨茎段作为外植体，用质量百分数0.05％的洗洁精浸泡10min，自来水冲洗20～30min，转入超净工作台，用无菌水冲洗3次，在75％乙醇中浸泡30～60s，无菌水冲洗3次后，用0.1～0.2％升汞消毒5～8min，无菌水清洗3次后，再用无菌吸水纸吸去表面水分，切成0.8～1.2cm带腋芽的茎段；

2)、无菌试管苗的获得及继代

将步骤1)获得的茎段接种于继代培养基上培养得到无菌试管苗，并进行不定芽的继代增殖；

所述步骤2)的继代培养基上培养的培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度1500～2000lx，光照周期为12h/12h；

所述步骤2)的继代培养基为改良的MS培养基+6-BA 0.1～1.0mg/L+NAA0.05～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，继代培养基pH值为5.8～6.2；