[发明专利]一种卤代醇脱卤酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种卤代醇脱卤酶突变体及其在合成阿托伐他汀关键中间体(3R,5R)6‑腈基‑3,5‑二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述卤代醇脱卤酶突变体HheC‑A氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。本发明提供了的1株卤代醇脱卤酶突变体，与野生酶相比，其催化活性提高了22倍，比活力提高了约20倍。将突变体HheC‑A用于全细胞催化D3转化A7的反应过程，当D3的投料量为50g/L时，9小时内D3转化率为92％，A7得率72％。突变体HheC‑A催化D3转化为A7的产物得率是野生酶HheC的4.8倍。

(一)技术领域

本发明涉及一种卤代醇脱卤酶的突变体及其应用。

(二)背景技术

心脑血管疾病是一种严重威胁人类，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位。2015年国内调血脂类药物总体市场已超过200亿元人民币，他汀类药物独占鳌头，国内他汀药物终端零售价市场达到了151.43亿元的规模，占整个降血脂用药市场近80％。其中，阿托伐他汀上市近20年的临床证明，药物安全性高、不良反应小，在降低LDL胆固醇治疗方面优于其它他汀类药物。2015年，中国阿托伐他汀总体市场达到了83.19亿元，同比上一年增长了7.97％，并仍呈现逐年上涨的趋势。

随着市场竞争的日益加剧以及企业社会责任的落实，阿托伐他丁的生产技术亟需改进和创新，一方面需减少工业生产对环境资源的破坏及能源的浪费，另一方面可降低企业成本和患者用药成本，以提升整个行业的经济效益和社会效益。采用生物催化技术升级阿托伐他汀药物关鍵中间体合成技术，能够建立节能、绿色、高效的新生产工艺。卤代醇脱卤酶具有一步转化法替代高能耗和高溶剂用量的化学合成步骤，具备高效催化的特性，适用于建立低能耗、低成本和环保的阿托伐他汀侧链合成新工艺。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种高效催化合成阿托伐他汀关键中间体(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)合成的卤代醇脱卤酶突变体及其应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种卤代醇脱卤酶突变体(HheC-A)，所述卤代醇脱卤酶突变体HheC-A氨基酸序列SEQ ID NO.2所示。本发明所述卤代醇脱卤酶突变体HheC-A基因是将源于根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens卤代醇脱卤酶HheC(氨基酸序列SEQ ID NO.4)的人工合成基因，进行体外定向进化后，最终筛选得到的突变体。

本发明还提供一种所述卤代醇脱卤酶突变体的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还涉及一种所述编码基因构建的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌。优选以pET28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主(大肠杆菌BL21(DE3))。

本发明还提供一种所述卤代醇脱卤酶突变体在合成阿托伐他汀关键中间体(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用，所述的应用以含卤代醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的含湿菌体的发酵液为反应介质，以(3R,5S)6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)为底物构成pH 8.0-9.0的反应体系，在35℃进行转化反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(3R,5R)6-腈基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)。

进一步，所述反应体系中，湿菌体用量为10～30g/L发酵液，所述底物终浓度为50g/L发酵液。

进一步，所述发酵液按如下方法制备：