[发明专利]用于检测大豆DNA的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR试剂盒

说明书

本发明提供用于检测大豆DNA的特异性引物和探针，所述探针序列为：5’‑AACCCTATCCTCACCCACTCG‑3’；所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物序列为5’‑CGATGTGGTCGATTTGAAGA‑3’；下游引物序列为5’‑AAAGCACGTCATGCGATTC‑3’。本发明还提供相应的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的特异性引物和探针以及相应试剂盒能够用于大豆DNA的实时荧光定量PCR检测，且所建立的方法具有高敏感性和高特异性，能够从花生、胡麻、玉米、大豆、土豆、芝麻、油菜、核桃、葵花、橄榄等多种油料作物中特异性鉴别大豆DNA。

技术领域

本发明属于分子生物学和体外诊断试剂技术领域，具体涉及用于检测大豆DNA的特异性引物和探针以及实时荧光定量PCR试剂盒。

背景技术

检测食用油DNA质量的基因主要有叶绿体ATP、RBCL基因和物种特异性基因。叶绿体是植物细胞重要的细胞器，叶绿体DNA被广泛用于系统进化的研究。叶绿体基因具有高度的保守型，而其中rbcL基因正是由于其进化特点而被广泛用于植物系统发生的研究。它的一些编码区在进化过程中速率较慢，比较保守，而一些非编码区在不同的物种间进化速度却比较快，具有一定的种间差异性和种内保守性，因而适合进行物种鉴别。通过对rbcL基因上一段序列进行通用引物设计，可以对不同的物种同时进行扩增，且同时具有种间差异性，在不同的物种之间差异比较大，易于进行物种鉴别。叶绿体基因在多数植物中以多拷贝形式存在，所以对于DNA含量甚微的精炼食用油，比单拷贝或少拷贝的物种特异性基因具有更高灵敏度的优势。物种特异性参照基因需要满足以下2个条件：该作物所有品种都存在该基因；其他生物没有或不存在扩增该基因的特异靶序列。通过建立物种特异性PCR方法来检测食品加工品中的该物种，逐渐成为食品质量检测的重要手段。

实时荧光定量PCR(Fluorescence quantitative PCR)技术从常规PCR定性检测迈上量化的台阶，它相对常规PCR技术先进、操作简便、利用实时荧光定量PCR技术能够实现实时监测、绝对定量和快速检测的目的，同时具有灵敏度高、特异性好、操作便捷等优点，因此非常适合临床检测。

实时荧光定量PCR技术有很多分支，其定量方式也不同，主要分为荧光染料嵌入技术、荧光探针技术和自身淬灭荧光技术等。荧光染料嵌入技术是利用SYBR green I嵌入DNA双链是荧光强度增加的特性，将荧光信号引入双链DNA，该方法特异性较差，结果常受到引物二聚体的存在的干扰而导致假阳性等问题，因此不适合用于食品快检。而荧光探针技术如Taqman技术、分子信标技术等因为其特异性比荧光染料嵌入技术和自身淬灭荧光技术要好，因此更适合食品检验使用。

发明内容

本发明目的在于设计一组大豆DNA的特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于食品检验的快速、灵敏、特异性好的用荧光定量PCR检测方法。本发明采用基因克隆技术，将大豆的Lectin基因片段插入到载体pMD18-T中，获得含有LectinDNA基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据大豆的LectinDNA的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。

针对目前市场上频繁出现的食用油掺假行为，本发明以常见的油料作物大豆为研究对象，结合常规PCR、实时荧光PCR，研究建立油料作物大豆和食用大豆油的实时荧光探针PCR方法，旨在构建快速、简便、准确和高效的常见食用油掺假分子生物学鉴别技术体系，为食用油质量监管和控制提供科学手段。运用分子生物学技术对食用油进行掺假检测，首要前提是从油脂中提取出适合PCR扩增的DNA。由于精炼食用油生产需经过高温及高压等处理，其中的DNA降解为大小不一的碎片，且含量极低，这给DNA提取造成了很大困难。因而DNA提取技术成为食用油PCR检测技术的瓶颈，是食用油检测成功与否的关键所在。本发明采用分子生物学相关技术，开展食用油品种鉴别技术研究，将为食用油产品的质量安全管理提供科学手段，有利于国内食用油市场的规范、高端食用油进出口贸易的顺利进行和整个食用油行业的健康发展。