[发明专利]一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用

说明书

本发明提供一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用，采用基因敲除技术，获得突变的PK‑15细胞，利用此突变的PK‑15细胞可快速复制并获得高滴度的PCV2病毒，进而为PCV2致病机制研究和PCV2灭活疫苗和减毒疫苗制备提供高效的病毒扩增细胞。

技术领域

本发明涉及猪圆环病毒2型(PCV2)毒株快速扩增细胞株的建立，具体涉及敲除pMKRN1的猪体细胞的构建。

背景技术

猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus associated disease,PCVAD)是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)引起的，主要包括猪皮炎肾病综合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、仔猪传染性先天性震颤(congenital tremors,CT)和断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemicwasting syndrome,PMWS)等多种疾病。虽然PCV2能在PK-15细胞中复制，但是复制效率相对较低，这不仅给PCV2致病机制研究带来了较大的困难，而且给PCV2疫苗株的生产带来了极大的困难，造成了PCV2疫苗的高生产成本。因此，获得一株能够显著提高PCV2复制能力的细胞株是目前研究PCV2致病机制和疫苗生产亟待解决的关键问题。

研究表明，人的MKRN1对包括病毒蛋白在内的多种底物蛋白具有E3泛素连接酶的作用。但对于PCV2而言，目前仅报道了PCV2在PK-15细胞中与porcine MKRN1(pMKRN1)结合。pMKRN1结合后对于PCV2的主要结构蛋白成分，即其衣壳蛋白(Cap)有怎样的作用，带来怎样的影响，并未得到研究。PCV2的Cap是由234个氨基酸(aa)组成的单肽链蛋白，其具体氨基酸序列可以参考“Ultrasensitive Detection of RNA and DNA Viruses SimultaneouslyUsing Duplex UNDP-PCR Assay”，其包含11个赖氨酸。目前发现的PCV2毒株主要包括2a亚型、2b亚型等，比对分析2a亚型与2b亚型发现164位和179位的赖氨酸高度保守，191位氨基酸不同。

发明内容

本发明的目的在于提供一种pMKRN1基因敲除的猪体细胞及其制备方法和应用。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基因敲除细胞，该细胞为pMKRN1基因敲除的猪体细胞。

优选的，所述猪体细胞选自pMKRN1基因敲除的PK-15细胞。

优选的，PCV2病毒在所述猪体细胞内不被泛素化蛋白酶体途径所降解。

优选的，所述猪体细胞是利用CRISPR-Cas9系统完成基因敲除的。

优选的，所述CRISPR-Cas9系统用于靶向pMKRN1基因组的gRNA的序列如下所示：

gRNA64-oligo1：5'-CAGTCACCTCCCCGTCCCCG-3'(SEQ.ID.NO.5)；

gRNA64-oligo 2：5'-CGGGGACGGGGAGGTGACTG-3'(SEQ.ID.NO.6)。

优选的，所述CRISPR-Cas9系统用于靶向pMKRN1基因组的gRNA的序列如下所示：

gRNA266-oligo1：5'-CACCGTATGGACTGTCAGAG-3'(SEQ.ID.NO.7)；

gRNA266-oligo2：5'-CTCTGACAGTCCATACGGTG-3'(SEQ.ID.NO.8)。

上述基因敲除细胞的制备方法，包括以下步骤：