[发明专利]一种动物细粒棘球蚴病ELISA抗体检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种动物细粒棘球蚴病ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括EgAgB8/2重组抗原预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。所述EgAgB8/2重组抗原是通过以下方法制备的：首先用RT‑PCR扩增EgAgB8/2基因cDNA，克隆EgAgB8/2基因，构建原核表达载体pET‑EgAgB8/2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，用IPTG诱导原核表达载体表达，离心收集菌体，用细菌裂解液溶解后超声破碎，离心收集上清，用Ni‑NTA胶进行纯化。本发明以重组蛋白EgAgB8/2为抗原来检测动物细粒棘球蚴病抗体，能够用于动物细粒棘球蚴病抗体的定性检测，具有抗原来源稳定、特异性好、灵敏度高、重复性好的优点。

技术领域

本发明属于基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种动物细粒棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

棘球蚴病又称包虫病是多发性人兽共患寄生虫病，呈世界性分布，是危害我国西部地区发展和人民健康的最严重的寄生虫病。棘球绦虫的成虫寄生于食肉类动物犬、狐狸、狼等的小肠上段，利用顶突小钩及吸盘固定于肠绒毛基部隐窝内。中间宿主为偶蹄类如羊、牛、骆驼、鹿、鼠、某些啮齿类等以及灵长类(包括人)动物。犬、狐狸和狼等动物是棘球蚴病的主要传播者。全世界流行的棘球绦虫有5中，我国有其中3种流行，分别为细粒棘球绦虫、多房棘球绦虫和石渠棘球绦虫，细粒棘球绦虫引起细粒棘球蚴病，严重危害人和动物的健康。

目前，棘球蚴病常用的血清学诊断抗原是棘球蚴囊液,由于其成分复杂,与其他蠕虫病患者血清有严重的交叉反应和非特异性反应,因此假阳性问题难以克服,诊断特异性不理想且来源有限、不稳定。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种动物细粒棘球蚴病ELISA抗体检测试剂盒，能够用于动物细粒棘球蚴病抗体的定性检测，具有抗原来源稳定、特异性好、灵敏度高、重复性好的优点。

抗原B(AgB)被公认为是细粒棘球蚴特异性囊液抗原,占包囊液中主要抗原的90％，并且含量稳定。AgB是细粒棘球蚴囊液中的一种分子量为120～160kDa耐热脂蛋白。X衍射分析发现其含有50％α螺旋结构，SDS-PAGE发现其存在8、12、16、20和24kDa分子。目前已经发现了5个抗原B亚单位，包括EgAgB8/1，EgAgB8/2，EgAgB8/3，EgA gB8/4和EgAgB8/5。研究证实重组EgA gB8/2的敏感性和特异性均比天然抗原B和重组EgAgB8/1高。本发明选择EgAgB8/2基因，采用分子生物学方法，克隆EgAgB8/2基因，构建原核表达载体 pET-EgAgB8/2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，诱导原核表达载体表达，通过SDS-PAGE检测，上清中有大量目的蛋白表达。纯化的蛋白经Western blot鉴定为目的蛋白。用纯化的 EgAgB8/2蛋白，建立了一种检测细粒棘球蚴抗体的ELISA检测试剂盒。

本发明公开的一种动物细粒棘球蚴病ELISA抗体检测试剂盒,所述检测试剂盒包括细粒棘球蚴重组抗原B8/2(EgAgB8/2)预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。

进一步，EgAgB8/2重组抗原是通过以下方法制备的:首先用RT-PCR扩增EgAgB8/2基因 cDNA，克隆EgAgB8/2基因，构建原核表达载体pET-EgAgB8/2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，用IPTG诱导原核表达载体表达，离心收集菌体，用细菌裂解液溶解后超声破碎，离心收集上清，用Ni-NTA胶进行纯化。

进一步，抗原包被的方法为：将纯化的EgAgB8/2重组蛋白用pH 8-10的碳酸盐缓冲液稀释至3-8ug/ml，包被酶标板,每孔60-120ul/孔，3-8℃过夜,用洗涤液洗2-5次，每次3-5min，甩干，加入含2-8％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，每孔100-300ul/孔，并置于30-40℃温箱内封闭0.5-1.5h，取出甩干，洗涤液洗涤2-5次，每次2-5min，甩干，真空包装后置于4℃保存备用。