[发明专利]一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用

说明书

本发明公开了一种高表达β‑甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株及应用，所述的工程菌为：毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115‑syn‑Man，保藏编号：CCTCC NO：M2017827。申请人将syn‑Man插入表达载体pPIC9K中获得pPIC9K‑syn‑Man，再优化载体中信号序列，同源重组等方法，提高syn‑Man序列在毕赤酵母中的拷贝数，用不同浓度的抗生素G418筛选含有高拷贝整合质粒的重组GS115菌株，最终筛选得到一株表达量稳定，抗性和酶活最高的菌株。通过50L发酵罐中高密度发酵，156h获得β‑甘露聚糖酶活达到最高值110000 U/mL，显示出良好的应用前景。

技术领域

本发明属于基因生物工程技术领域，具体涉及一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工 程菌株及应用。

背景技术

β-甘露聚糖酶来源广泛，存在于低等动物如海洋软体动物Mytilus edulis、Littorina ber vicula、pomacea insularus、Helix lucorum等；也存在于植物的储藏器官中，如魔芋球茎和 种子，如南欧紫荆、番茄、莴苣、黄桧、芝麻等；但微生物仍是β-甘露聚糖酶的主要来源。 细菌、放线菌和真菌中均有多种常见类群可以产生β-甘露聚糖酶。例如细菌中的革兰氏阳 性菌芽孢杆菌包括芽孢杆菌(Bacillus species)和梭菌(Clostridiaspecies)，少数的革兰 氏阴性菌，弧菌(Vibrio)和拟杆菌(Bacteroides)，还有一些嗜热菌和极端微生物。微生 物来源的β-甘露聚糖酶具有许多优点，酶活性高、生产成本低、提取方便，pH、温度作用 范围广以及底物专一性较高等。因此，微生物来源的β-甘露聚糖酶已得到了广泛应用。

β-甘露聚糖酶因其来源不同而性质迥异。一般来说，细菌中的β-甘露聚糖酶分子量多在 35kD-55kD之间，等电点多为4.0-5.5，其最适反应温度为50℃-70℃。不过嗜碱性芽孢杆菌 的最适pH值可达到9.0-10.0。不同微生物所产的β-甘露聚糖酶在分子量、最适反应条件、 等电点、底物专一性等方面均有一定的差异。真菌来源的β-甘露聚糖酶作用范围偏酸，最 适反应pH偏低，一般在4.0-5.5之间，最适反应温度一般在55-75℃之间，耐热性比较差， 如嗜温真菌Trichoderma harzianum T4产的甘露聚糖酶在55℃放置45分钟后酶活性就降低 了70％。细菌和放线菌来源的β-甘露聚糖酶作用范围广，pH在5.0-9.5之间，最适反应温度 在40-90℃之间。

随着对β-甘露聚糖酶的深入研究，该酶在造纸、饲料、洗涤、纺织、食品、医药和石油开采等工业领域中得到了广泛的应用，特别是在造纸和饲料工业中。此外，β-甘露聚糖酶作为一种工具酶在糖结构的分析和植物基因工程等生物研究领域中有重要用途。

发明内容

本发明目的在于提供一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌，所述的菌株已于20 17年12月22日，送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M201782 7，分类命名：毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115-syn-Man，地址：中国武汉武汉大学。

本发明的另一个目的在于提供了一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌在生产β -甘露聚糖酶中的应用。

本发明的最后一个目的在于提供了一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的发酵 方法，方法简单，适用于大规模生产。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种高表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌的获得：