[发明专利]微量细胞ChIP法

说明书

本发明涉及一种微量细胞ChIP法。所述方法包括：1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；2).将第n组样品交联固定；3).使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；4).使用Tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段DNA的两端；当n≥2时，步骤4)中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；5).当n≥2时，将各组样品合并；6).富集与靶蛋白结合的DNA片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析。该方法测序时建库效率高，且能实现对极微量细胞的转录因子位点捕捉，并保证较好效率，稳定性和精确度都较好。

技术领域

本发明涉及分子生物学实验技术领域，具体而言，涉及一种微量细胞ChIP法。

背景技术

生物的基因调控和表达是极其复杂但有序的过程，生物体基因组DNA在细胞中以染色质形式存在，蛋白质和DNA互作是细胞行使功能的重要基础。因此，研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用可以进一步了解基因表达及其调控模式。

染色质免疫共沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation,ChIP)是研究DNA-蛋白质在体内相互作用的标准方法。染色质免疫共沉淀技术可以定位分析体内蛋白质与DNA的作用位点，运用ChIP技术与其他方法相结合，例如与高密度芯片(microarray)、测序(sequencing)、体内足迹法等技术相结合可以获得整个基因组水平的单一转录因子分布图谱、反式因子体内结合位点，以及系统揭示核小体定位、组蛋白修饰等表观遗传的遗传机制。

ChIP技术的一般技术流程为：首先对细胞或组织进行不同时间的甲醛交联，分别裂解细胞膜及细胞核，使用超声方式将染色质打碎成一定长度范围的片段。加入抗体，抗体会特异性地与靶蛋白结合，而后通过磁珠与抗体的相互作用，将靶蛋白及与其结合的DNA片段富集。解交联并消化蛋白后，对捕获的DNA片段建库，进行第二代测序。根据数据片段在基因组上的富集情况，进而获得全基因组水平的特定蛋白与DNA相互作用的图谱。

然而，现有的ChIP-seq技术主要存在如下问题：

1.建库效率低，不适用于少量细胞实验

利用适当的超声条件获得片段大小合适的DNA-染色质复合物是整个染色质免疫共沉淀实验成功的前提，然而使用超声法打断的ChIP-seq技术对细胞数量有一定的要求，适用于几万至百万数量级的细胞处理。主要原因是传统Illumina的TruSeq建库策略中的adaptor与DNA片段连接效率较低，而使得很多片段在后面的扩增集中没有被富集而丢失。尤其当研究的问题需要针对少量细胞群体的时候，严重的信息丢失使得实验者无法获得较为准确的真实信息。

2.超声法打断染色质片段方法不利于与DNA间接结合的转录因子的研究

全基因组范围内，有很多转录因子不是与基因组DNA直接结合的，而是与其他转录因子结合后，间接地结合在基因组DNA上。即使是甲醛交联过的样品，这种间接结合也比较容易被破坏。超声过程具有一定程度的物理破碎强度，容易干扰这些间接结合靶蛋白与DNA结合的稳定性，而造成后续信息的丢失。

3.文库非特异性背景较高，检测分辨率低

超声打断法是对染色质进行随机打断，获得一定长度范围内的片段。因此，在靶蛋白及DNA复合物的周围也带有一些非靶蛋白特异结合的DNA序列或是其他蛋白结合的位点。这些非特异性位点在后面建库测序过程中均会被保存下来，成为靶蛋白图谱分析的干扰背景，获得宽峰，降低了检测结合位点的分辨率和准确性。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明涉及一种微量细胞ChIP法，包括：

1).将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；

2).将第n组样品交联固定；