[发明专利]微量细胞ChIP法

权利要求书

1.一种微量细胞ChIP法，其特征在于，包括：

1）. 将待检测细胞样品分为n组，n为非0自然数；

2）. 将第n组样品交联固定；

3）. 使用细胞膜打孔剂处理所述第n组样品；

4）. 使用Tn5转座酶酶切打断第n组样品的染色质片段，并将barcode序列和引物序列连接在产物片段DNA的两端；

当n≥2时，步骤4）中每组所用的barcode序列和/或引物序列不同；

5）. 当n≥2时，将各组样品合并；

6）. 富集与靶蛋白结合的DNA片段，并用以所述引物作为index建库，测序分析；

在步骤1）之后、步骤2）之前还包括：使用含有SDS的溶液松散甲醛交联过的细胞样品中的染色质；所述含有SDS的溶液中SDS的浓度为0.1 w/v%~1.0 w/v%；所述使用含有SDS的溶液松散甲醛交联过的细胞样品中的染色质的步骤具体包括：将所述细胞样品使用含有SDS的溶液于37℃下处理3min；交联为用1 v/v %浓度的甲醛交联细胞3min；

在步骤2）之后、步骤3）之前还包括：超声处理以打开染色质紧密结构；所述超声处理的条件为：140 Hz~180 Hz，超声10s~20s；

在步骤4）中，在所述Tn5转座酶酶切的反应体系中包括来自第i组样品染色质、连接有所述barcode序列和所述引物序列的Tn5转座酶；所述Tn5转座酶在所述反应体系中的终浓度为：0.01~0.05 μl/20μl；所述Tn5转座酶酶切的反应条件为：37℃孵育5min~60min。

2.根据权利要求1所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，所述第n组样品的细胞数目≥1。

3.根据权利要求2所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，1≤所述第n组样品的细胞数目≤1000000。

4.根据权利要求3所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，1≤所述第n组样品的细胞数目≤1000。

5.根据权利要求1所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，在步骤2）中，所述细胞膜打孔剂具体为含有Triton X-100的溶液。

6.根据权利要求5所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，所述含有Triton X-100的溶液中Triton X-100的浓度为0.5 v/v %~2 v/v %。

7.根据权利要求6所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，所述使用细胞膜打孔剂处理细胞的处理条件为：10℃~37℃孵育5min~60min。

8.根据权利要求1所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，在步骤5）之后、步骤6）之前还包括：

对步骤4）或5）所得到的样品离心弃上清，用含有0.01 w/v%~0.05 w/v% SDS的稀释缓冲液重悬沉淀，于0℃~6℃孵育裂解20min~60min；超声处理将目的DNA片段从细胞核中释放出来。

9.根据权利要求8所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，在SDS的稀释缓冲液重悬沉淀之后、超声处理将目的DNA片段从细胞核中释放出来之前还包括：超声打散沉淀；所述超声打散沉淀的超声条件为：140 Hz~180 Hz，3s~7s。

10.根据权利要求8所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，所述超声处理将目的DNA片段从细胞核中释放出来的超声条件为：140 Hz~180 Hz，每个循环内：10s~20 s ON，20 s~40sOFF。

11.根据权利要求1所述的微量细胞ChIP法，其特征在于，在步骤6）中，所述富集与靶蛋白结合的DNA片段的方法包括：

加入靶标蛋白对应的抗体孵育后，用偶联Protein A的珠子拉取所述抗体，用洗脱液对所述珠子洗脱，对洗脱液进行解交联处理并用蛋白酶K消化处理。