[发明专利]一种青枯病菌噬菌体微生态制剂及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种青枯病菌噬菌体微生态制剂及其制备方法和应用，属于微生物技术领域。所述制备方法是将青枯病菌液和青枯病菌噬菌体液接种至发酵培养液中进行发酵培养；在发酵培养进行至8～20h时，向宿主发酵液中流加青枯病菌液，继续发酵培养，整个发酵周期控制在24～48h，然后对发酵液进行灭活青枯病菌宿主，得到青枯病菌噬菌体微生态制剂。本发明通过控制发酵流加时机为发酵培养进行8～20h，流加宿主液，能够实现不延长发酵时间的前提下，大大提高青枯病菌噬菌体的效价。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种青枯病菌噬菌体微生态制剂及其制备方法和应用。

背景技术

目前，控制和消除致病菌的主要手段仍是各种物理或化学的方法，包括各种抗生素的使用。物理或化学的方法都存在着明显的弊端。首先，物理的方法对各种致病菌的消除作用只能应用于相关领域的某一环节，不能实现整个领域所有环节的应用。其次，化学方法中的酸碱处理虽可以取得一定防治效果，但在有害菌形成生物膜后，这些方法的效果就极不理想。微生物生态制剂的研究开发受到各方关注，特别是噬菌体的研究受到人们的青睐。从噬菌体被Frederick Twort(1915)和Félix DHérelle(1917)发现开始，欧洲和前苏联等国家，就已经便开始用噬菌体来治疗细菌感染。然而在青霉素、链霉素等抗生素的崛起，以及早期噬菌体药物失效快等缺点这些药物很快就被淘汰了。抗生素虽然开始使用效果显著，但是长期使用，不仅会增强病原菌的抗药性，而且抑制有益菌群，最终不能有效地控制、消除致病菌。20世纪90年代末，很多科研工作者倡导重新应用噬菌体到临床治疗上来，噬菌体疗法逐渐复苏。此外，噬菌体本身具有广泛的应用，例如用于细菌鉴定和分型，用于诊断和治疗疾病，还用作分子生物学研究的实验工具。因此，噬菌体广泛的应用价值促进噬菌体的发酵生产越来越受到人们的关注。

目前，噬菌体的发酵生产方法有很多，例如，专利申请号为94114314.7，名称为“噬菌体生态制剂的制备方法”的发明专利申请提出一种培养基培养方法：在10L放水瓶，装液为5000ml使用宿主弧菌培养噬菌体5～7天，最终噬菌体效价为10⁵～10⁸PFU/ml。专利申请号200810145709.5的发明专利使用宿主弧菌冻干粉作为营养源，噬菌体的效价也不高，为1×10⁷PFU/ml。专利申请号200810202809.7的发明专利中使用嗜水气单胞菌进行噬菌体的生产，发酵周期长，为72～120h，噬菌体效价为1×10⁸PFU/ml。上述专利中公开的噬菌体的发酵方法均存在噬菌体效价低的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种青枯病菌噬菌体微生态制剂及其制备方法和应用，所述制备方法发酵得到高效价的青枯病菌噬菌体。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种青枯病菌噬菌体微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)将青枯病菌液接入发酵培养基中培养，得到宿主发酵液；青枯病菌在发酵培养基中的初始菌体浓度为10⁸～10¹⁴CFU/ml；

2)将浓度为10¹⁰～10¹⁴PFU/ml的青枯病菌噬菌体液接种至所述宿主发酵液中发酵培养；所述青枯病菌噬菌体液的接种量为1％～10％；

3)所述步骤2)中发酵培养进行8～20h时，向所述步骤2)中的宿主发酵液中流加青枯病菌液，继续发酵培养，控制整个发酵周期为24～48h，得到发酵液；

4)将所述步骤3)中得到的发酵液进行灭活青枯病菌，得到青枯病菌噬菌体微生态制剂。

优选的，所述步骤3)中青枯病菌液的流加体积为初始噬菌体发酵液的体积的1％～10％；流加的青枯病菌液的浓度为10¹⁰～10¹⁴PFU/ml。