[发明专利]微卫星稳定性状态检测的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种微卫星稳定性状态检测的方法和试剂盒，所述方法针对5个高度灵敏性和特异性的准单态性单核苷酸重复位点进行检测，所述5个准单态性单核苷酸重复位点为：NR‑21、NR‑24、BAT‑25、BAT‑26和MONO‑27。本发明的方法还包括对2个多态性好的五核苷酸重复位点：Penta D和Penta E进行同步检测，以确保检测样本来源相同，避免检测样本混淆。

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种多重检测体系及试剂，具体涉及一种微卫星稳定性状态检测的方法及试剂盒，特别涉及所述微卫星稳定性状态检测的方法和试剂盒在免疫治疗和林奇综合征辅助诊断中的应用。

背景技术

1980年Wyman等首先提出微卫星序列，该序列是由2-6个核苷酸组成，以二核苷酸的重复序列(CA/GT)n最为常见。正常细胞在增殖过程中，有完整的DNA错配修复系统，其可以及时发现微卫星序列复制错误并迅速修正，使得微卫星序列高保真复制，从而维持微卫星稳定。部分肿瘤在发生过程中由于DNA错配修复功能缺陷(dMMR)不能及时发现微卫星序列在复制过程中的错误，从而导致重复单位插入或缺失引起微卫星序列长度的改变进而导致Microsatellite instability(MSI)。目前的研究倾向认为，由于细胞错配修复系统功能受损导致微卫星序列重复掺入或缺失，引起微卫星序列长度发生改变，从而表现出MSI。

MSI检测基因位点，在1997年NCI推荐使用BAT-25(单核苷酸重复)，BAT-26(单核苷酸重复)，D2S123(两核苷酸重复)，D5S346(两核苷酸重复)，D17S250(两核苷酸重复)5个基因检测位点，同时定义：2个及2个以上基因位点变异称为高微卫星不稳定(MSI-H)，1个基因位点变异称为低微卫星不稳定(MSI-L)，没有基因位点变异称为微卫星稳定(MSS)，也既Bethesda标准。在之后几年的科研及临床应用上发现，选择两核苷酸重复的基因位点容易产生DNA聚合酶滑脱产物(英原文为stutter)，特异性及敏感性没有单核苷酸重复基因位点好。所以在2002年时，Bethesda标准进行了修正，MSI检测推荐使用单核苷酸重复基因位点，2004年，Promega公司的Jeffery等人对MSI检测的核苷酸重复基因位点进行了系统的分析，结果显示：在特异性及灵敏度方面，单核苷酸重复基因位点要优于两核苷酸重复基因位点和三核苷酸重复基因位点。

我国结直肠癌的发病率逐年增高，在恶性肿瘤中其发病率位居第四位，而在欧美发达国家位居恶性肿瘤第二位。Lynch综合征，亦称遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，是由MMR基因胚系突变所致的显性遗传病。90％以上的Lynch综合征具有MSI特征，而散发性结直肠癌中只有约15％，所以临床上可用MSI检测来进行Lynch综合征的筛查。Lynch综合征患者及其家族成员常见结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、卵巢癌等多种Lynch综合征相关肿瘤，因此MSI检测对于患者本人及其家族成员均有重要意义。Bethesda标准建议疑似Lynch综合征的患者进行MSI检测，MSI检测现已成为筛选Lynch综合征的的必检项目。MSI结直肠癌患者对5-氟尿嘧啶为主的化疗不敏感，同时MSI结直肠癌患者较MSS患者的预后效果好，说明MSI检测可用于结直肠癌的用药指导和预后预测。

Programmed death 1(PD-1)是通过解除肿瘤细胞逃避免疫系统的新型免疫疗法，PD-1免疫疗法的作用机制是针对PD-1或PD-L1设计特定的蛋白质抗体，阻止PD-1和PD-L1的识别过程，部分恢复T细胞功能，从而使T细胞可以杀死肿瘤细胞。其中PD-1抗体药Keytruda成为首款“广谱抗癌药”，用于治疗“MSI-H/dMMR亚型”的实体瘤，这是美国FDA首次基于肿瘤生物标志物而不是肿瘤原始位置批准了一个新药。

鉴于微卫星稳定性状态检测在遗传背景分析、药物响应、免疫疗法预后等方面的重要意义，选择适当的重复位点开发改良的、便捷的、高灵敏度的微卫星稳定性多重检测体系及检测试剂盒十分必要。

发明内容