[发明专利]一种检测人类ctDNA基因突变的试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人类ctDNA基因突变的试剂盒。所述试剂盒包含多重PCR扩增引物和延伸引物，所述多重PCR扩增引物由SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:10组成，所述延伸引物由SEQ ID NO:11～SEQ ID NO:15组成。所述试剂盒的检测步骤包括将待测样品进行PCR扩增，所得PCR扩增产物进行SAP处理，利用PCR对扩增产物进行单碱基延伸，延伸后通过磁珠富集延伸产物，应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术对延伸产物进行检测，区分飞行时间长短并分析数据。本发明的试剂盒能同时检测多个突变位点，具有高通量、高精度、低成本的特点。

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术领域，具体地，涉及一种检测人类ctDNA基因突变的试剂盒。

背景技术

游离DNA(Cell Free nucleic acids, cfDNA)是指存在血浆或者血清、脑脊液等细胞外游离状态的核酸片段，约160～180bp，是细胞DNA在生理或病理条件下的产物。研究表明肿瘤病人外周血中存在的cfDNA显著高于健康人群，并且这些cfDNA携带有肿瘤患者的基因的变异信息（包括肿瘤基因的突变等），称之为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA）。ctDNA主要来源于坏死的肿瘤细胞，循环肿瘤细胞，凋亡的肿瘤细胞以及来自肿瘤细胞的外分泌小体。通过ctDNA的检测，可以为临床判断患者预后，决定用药方案提供参考。

临床发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗的疗效具有相关性，且在亚裔人群中，EGFR基因突变占非小细胞肺癌的35%左右。绝大多数携带EGFR基因突变的病人疗效显著。大量研究资料表明EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区(tyrosine kinase codingdomain) 外显子18～21上，编码了激酶结构域的21号外显子上的L861Q突变导致了在EGFR中861位密码子中从亮氨酸到谷氨酰胺的氨基酸置换。这个突变在EGFR突变的肺癌中约占2%。对EGFR基因突变的检测对于指导NSCLC病人临床用药具有重要的参考价值。

研究发现KRAS基因发生异常时，导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭，不能产生正常RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。KRAS-突变发生于多种癌症，例如肺癌、结肠癌等。90%的突变发生在12、13位密码子，KRAS-G12D突变导致在KRAS 12位密码子从甘氨酸到天冬氨酸的氨基酸置换，KRAS-G12S突变导致在KRAS 12位密码子从甘氨酸到丝氨酸的氨基酸置换，KRAS-G13D突变导致在KRAS 13位密码子从甘氨酸到天冬氨酸的氨基酸置换。这些突变可导致p21-ras蛋白的生长信号的异常变化。该基因是TKIs治疗的靶分子，携带有KRAS基因突变的患者对TKIs治疗不敏感。大量临床研究表明，靶向药物对未发生KRAS基因突变的患者有效率可达到60％，而对已发生KRAS基因突变的患者则完全无效。KRAS基因检测是目前医生了解患者癌基因状况最直接、最有效的方法。通过检测KRAS基因有没有突变，可以筛选出抗EGFR（表皮生长因子受体）靶向药物治疗有效的大肠癌患者，实现肿瘤病人的个体化治疗，从而延长患者生存期。对于没有突变的患者，则能减少不必要的治疗费用和毒副作用。

研究表明，在多种人类恶性肿瘤中，如肺癌、恶性黑色素瘤、结直肠癌等均存在不同比例的BRAF基因突变。大约80～90%的BRAF基因突变发生在exon15的1799核苷酸上，T突变为A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)。目前认为，V600E突变可模拟T599和S602两个位点的磷酸化过程，从而使BRAF蛋白异常激活。BRAF突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结果有关。临床研究显示，BRAF基因突变患者对EGFR靶向药物可能存在原发耐药，因此NCCN建议，在使用靶向药物时应对KRAS基因野生型患者进一步检测BRAF基因状态。BRAF基因突变检测能提高临床治疗的针对性，指导靶向药物的合理使用，避免无效或治疗不当造成的病人病情延误，降低治疗风险。