[发明专利]犬干扰素-α6α7重组蛋白及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种犬干扰素‑α6α7重组蛋白及其制备方法与应用。所述犬干扰素‑α6α7重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，可按如下方法制备：对犬干扰素‑α6基因、犬干扰素‑α7基因分别进行密码子优化，将优化后的基因序列进行拼接，克隆至pPICZαA中构建重组表达质粒，转化毕赤酵母，制备重组菌，然后进行发酵、诱导表达、纯化，获得犬干扰素‑α6α7重组蛋白。其可作为广谱抗病毒制剂，对犬瘟热、犬细小病毒病、犬副流感病毒病、犬传染性肝炎病毒感染的预防及治疗效果显著，为实现重组犬干扰素‑α6、α7串联重组蛋白工艺化生产和进一步广谱性预防和治疗犬的病毒性疫病提供有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及基因工程和生物制品领域，具体地说，涉及一种犬干扰素-α6α7重组蛋白及其制备方法与应用。

背景技术

干扰素(IFN)是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等生物学活性的细胞因子，是机体细胞在受到病毒、细菌内毒素以及其他诱生剂的刺激下，由受体细胞分泌的一种糖蛋白。根据干扰素产生的细胞、受体、活性等，可将其分为I型、II型和III型。I型干扰素主要由白细胞产生，包括：IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ。 IFN-α有多种亚型，成熟的IFN-α各亚型均含165-166个氨基酸残基，结构相似，分子量约为18kD。IFN-α含四个保守的半胱氨酸,共形成两对二硫键(Cys1-Cys99及Cys29-Cys139),从而使IFN-α分子折叠成球状, 球状构象对IFN-α的生物学活性起着重要作用。犬IFN-α基因全基因序列为564bp，包含1个开放阅读框，编码187个氨基酸的多肽，推导氨基酸序列有2个潜在的N-糖基化位点，有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。目前，研究者克隆了犬的8个IFN-α亚型，并且绘制了分子进化树，其中将CalFN-a分为2组：CalFN-al、2、7为一组；CaIFN-a3、4、 5、6、8为一组。

IFN-α具有广谱抗病毒活性,不仅可以抑制RNA病毒的复制,还可抑制多种DNA病毒的复制，其抗病毒活性主要表现在以下几个方面：①可通过促使病毒mRNA降解来抑制感染细胞中病毒mRNA的翻译。②可增强NK细胞对病毒的杀伤能力，并可作为一种可溶性细胞因子用以抑制和干扰病毒的繁殖，并刺激淋巴细胞分泌产生多种广谱抗病毒蛋白质。③通过T和B淋巴细胞或K细胞并在IgG的共同作用下，使感染病毒的宿主细胞溶解死亡从而阻断病毒的繁殖。④能提高细胞表面MHC I类分子的表达水平，向T细胞呈递抗原，促进病毒感染细胞发生溶解。

近年来，犬作为伴侶动物越来越多的出现在人们的生活中,犬的病毒性疾病及狂犬病等人畜共患病逐渐引起了人们的重视。因此，采用一种安全无副作用的药物来预防和治疗犬病毒病就显得尤为重要。

目前由于原核表达的重组干扰素一般不能进行翻译后修饰，与天然干扰素的空间构想有一定差距，其免疫原性较低，而真核表达系统能够进行转录和翻译后修饰，故其结构更接近于天然干扰素。

毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统作为一种新型的酵母表达系统，既有原核生物的特点，又有真核生物的特性，可以对目的蛋白质进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰。已有多种蛋白在此系统中高效表达，不存在原核表达系统的内毒素难以去除的问题，也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题，并可进行类似高等真核生物的信号肽剪切和糖基化等翻译后加工。表达载体pPICZαA的醇氧化酶启动子AOX1可用甲醇严格调控，表达盒的N端带有引导分泌表达的α-factor信号肽序列，表达产物可分泌到上清，它还拥有一个特点是其具有Zeocin抗性标记基因，给筛选转化子的工作带来很大的便利。再者甲醇营养型酵母表达系统具有高表达、高稳定、高分泌的特点，其宿主菌巴斯德毕赤酵母自身蛋白分泌量少，下游分离纯化操作易行，能大规模发酵生产，是一种适宜表达外源基因的真核表达系统。目前，尚未见利用酵母真核表达系统表达犬干扰素-α6、α7 串联重组蛋白的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种犬干扰素-α6α7重组蛋白及其制备方法与应用。