[发明专利]犬干扰素-α6α7重组蛋白及其制备方法与应用

权利要求书

1.犬干扰素-α6α7重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为：

a)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或

b)SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述重组蛋白的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列如SEQ ID NO:5所示。

3.含有权利要求2所述核酸序列的生物材料，所述生物材料为表达盒、表达载体、克隆载体或工程菌。

4.权利要求1所述重组蛋白的制备方法，其特征在于，对犬干扰素-α6基因、犬干扰素-α7基因分别进行密码子优化，将优化后的基因序列进行拼接，克隆至pPICZαA中构建重组表达质粒，转化毕赤酵母，制备重组菌，通过发酵、诱导表达、纯化，获得犬干扰素-α6α7重组蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，优化后的犬干扰素-α6基因和犬干扰素-α7基因序列分别如SEQ ID NO:1和3所示，拼接后的基因为CaIFN-α6-CaIFN-α7，序列如SEQ IDNO:5所示。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，重组表达质粒的构建方法如下：

将CaIFN-α6-CaIFN-α7与载体pPICZαA用XhoI和NotI进行双酶切，回收双酶切片段，将CaIFN-α6-CaIFN-α7基因片段与载体pPICZαA回收片段按3：1的摩尔比4℃连接过夜，构建成重组表达质粒pPICZαA-CaIFN-α6-α7。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，重组菌的制备、发酵及诱导表达如下：

用SacI单酶切重组表达质粒pPICZαA-CaIFN-α6-α7，线性化后的质粒电转化至感受态细胞X-33，在有Zeocin抗性的YPD平板上30℃培养3天，挑取阳性克隆菌提取质粒，进行鉴定，将鉴定正确的重组菌X-33/pPICZαA-CaIFN-α6-α7接种于20-30ml YPD液体培养基中，30℃，250rpm培养16～18h，至菌体OD₆₀₀＝2-6，1500～3000g，室温离心收集菌体；菌体沉淀用20mL BMMY培养基重悬至OD₆₀₀＝1.0-2.0，28-30℃，250rpm培养72h，每隔24h补加甲醇至终浓度为1.0-1.5v/v％。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，表达产物的纯化方法如下：培养结束后，收集培养液，离心获得上清，上清过滤后，用镍亲和层析柱对上清进行纯化，纯化后的犬干扰素-α6α7重组蛋白经过SDS-PAGE分析，用BCA法测定目的蛋白终浓度。

9.权利要求1所述重组蛋白、权利要求2所述核酸序列或权利要求3所述生物材料在制备广谱抗病毒制剂中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述病毒包括犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬传染性肝炎病毒、水泡性口炎病毒。