[发明专利]一种血管内皮干细胞的培养方法

说明书

一种血管内皮干细胞的培养方法，包括以下步骤：第一步、制备血管内皮干细胞；第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞。本发明利用消化法制备了血管内皮干细胞，并建立了三种气体(氧气、氮气、二氧化碳)培养体系培养扩增血管内皮干细胞。该技术具有高效、经济、便捷等优点，可促使血管内皮干细胞增殖速度、状态较常规的二氧化碳培养法更佳。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种血管内皮干细胞的培养方法。

背景技术

血管内皮干细胞(endothelial stem cells，ESC)是一类具有强大促进血管生成功能的干细胞。大量实验显示，血管内皮干细胞具有极低的免疫原性，同种异体ESC在人体内不诱导针对其干细胞的免疫应答；ESC还能在体内抑制炎性细胞因子如TNF-ɑ、IFN-Y的产生，同时促进抗炎性因子如IL-4的产生，以及促进T调节细胞(Tregulatory cells)的产生等。并且ESC可以诱导分化成各种细胞组织包括血管、神经、肌肉、骨骼和多种内脏器官等。

现有的培养技术，ESC细胞培养所使用的培养基成分较多，且价格昂贵，且体外培养10代以上，细胞容易出现衰老、退化现象，增殖效率降低，且在培养基中添加较多的细胞生长因子，会促进干细胞分化，对于维持其干性与稳定性不利，影响干细胞储存与研究质量。同时，氧气的浓度对于细胞的培养起着至关重要的作用，氧气浓度是决定细胞命运的一个关键因素，并可调节应激反应标志物的表达。有实验发现，氧气浓度的改变对细胞的生长状态也将发生改变。机体内的干细胞总是集中于氧气相对少的地方。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种血管内皮干细胞的培养方法，该方法尤其适用于脐带血管内皮干细胞的培养。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种血管内皮干细胞的培养方法，包括以下步骤：

第一步、制备血管内皮干细胞；

a、选取优质脐带，检测传染病源，传染五项指标均为阴性，则此脐带可进行下一步实验；

b、分离血管内皮干细胞，包括以下步骤：

①带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；

②在脐带的一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用两根粗丝线扎牢，并冲洗静脉腔，至将脐血洗净；

③赶出所述静脉腔内的残余液体，将脐带的另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶约6-8ml，放入37℃Cord Buffer中保温6-10min；

④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；

⑤离心，1500rpm，10min，弃上清液，收集细胞；

c、配制培养液；

d、培养液重悬细胞；

第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：

a、培养血管内皮干细胞；

通过充入氮气，调整O₂浓度为5％、20％，CO₂浓度设置为5％，将重悬的细胞进行培养；每隔3天换液，直至细胞长至80-90％；

b、细胞消化传代；

步骤b所得细胞，PBS洗涤两遍后，加入消化液，放入37度培养箱消化1min，培养液重悬细胞，进行分瓶传代培养；

第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；