[发明专利]一种血管内皮干细胞的培养方法

权利要求书

1.一种血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：

第一步、制备血管内皮干细胞；

、选取优质脐带，检测传染病源，传染五项指标均为阴性，则此脐带可进行下一步实验；

、分离血管内皮干细胞，包括以下步骤：

①带无菌手套，取出脐带，在止血钳内侧用碘酒和酒精棉球消毒后，用无菌剪刀将两端脐带剪除；

②在脐带的一端找到静脉，插入脐带静脉插管，用两根粗丝线扎牢，并冲洗静脉腔，至将脐血洗净；

③赶出所述静脉腔内的残余液体，将脐带的另一端用止血钳夹闭，用10ml注射器连接针头，注入37℃预热的0.1％胶原酶6-8ml，放入37℃ Cord Buffer中保温6-10min；

④吸出静脉腔内胶原酶所消化的细胞悬液，加入预加有20ml cord Buffer的离心管中，再冲洗静脉腔，一并加入离心管中；

⑤离心，1500rpm，10min，弃上清液，收集细胞；

、配制培养液；

、培养液重选细胞；

第二步、将第一步中分离的血管内皮干细胞进行培养：

、培养血管内皮干细胞；

通过充入氮气，调整O₂浓度为5%、20%，CO₂浓度设置为5%，将重悬的细胞进行培养；每隔3天换液，直至细胞长至80-90%；

、细胞消化传代；

步骤2所得细胞，PBS洗涤两遍后，加入消化液，放入37度培养箱消化1min，培养液重悬细胞，进行分瓶传代培养；

第三步、将第二步中获得细胞铺板进行增殖曲线实验；

取血管内皮干细胞，以1X10³个/孔接种于六块6孔板，每两块板为一组，每板接种4孔；其中第一组置于5%CO₂的条件下，第二组置于5% O₂、5%CO₂的条件下、第三组置于20% O₂、5%CO₂的条件下分别培养；培养24h后，将各板的第一孔进行消化，收集细胞，进行计数；同样，培养48h、72h、96h后分别进行同样操作，绘制增殖曲线；

第四步、将第二步中获得细胞收集进行流式检测鉴定干细胞；

收集P9代细胞，离心并再悬浮于1X PBS，于细胞计数仪上计数；细胞与CD45、 CD34孵育；所有抗体均直接标记；培育后，收集细胞，离心并重悬于1X PBS，立即采用流式细胞仪检测。

2.根据权利要求1所述的血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：所述传染五项包括甲肝、乙肝、丙肝、梅毒和艾滋病。

3.根据权利要求1所述的血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：所述步骤② 中，用30ml的注射器抽吸Cord Buffer冲洗静脉腔。

4.根据权利要求1所述的血管内皮干细胞的培养方法，其特征在于：所述第四步中，所有样品，CD34小于5%。