[发明专利]一种酶法制备乙酰辅酶A的方法

说明书

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种酶法制备乙酰辅酶A的方法。本发明利用酶法制备乙酰辅酶A的方法具体如下：首先将新阿波罗菌中的丙酮酸铁氧化还原蛋白酶基因，克隆到大肠杆菌表达载体中，制备重组酶丙酮酸铁氧化还原蛋白酶；然后，以丙酮酸钠、CoA等物质为原料，配制一定pH值的反应液，加入上述重组酶，置于70‑90℃无氧条件下反应，得到含有乙酰辅酶A的混合液。本发明采用的丙酮酸铁氧化还原蛋白酶，无氧条件下稳定性好，且耐高温不易失活，无需进行酶固定化，合成乙酰辅酶A操作简单；该催化反应具有很高专一性，无副产物产生，无需进行额外繁琐的纯化工艺，乙酰辅酶A的合成速率达15.01μmol/min/mg，有望用于工业化生产。

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种酶法制备乙酰辅酶A的方法，特别涉及一种极耐热性丙酮酸铁氧化还原蛋白酶(PFOR)合成乙酰辅酶A的方法。

背景技术

乙酰辅酶A是能源物质代谢的重要中间代谢产物，在许多代谢过程中起着关键的作用。乙酰辅酶A是糖类、氨基酸和脂肪酸等多种有机物代谢的中间产物。乙酰辅酶A广泛参与糖、蛋白质、脂肪和核酸等物质的代谢过程，包括分解代谢与合成代谢。

乙酰辅酶A被广泛应用到生物医学研究中，比如用于代谢疾病的药物研发，以脂类和聚酮化合物为基础的抗癌药物的研发。在脂肪酸、胆固醇、酮体为基础药物合成中，乙酰辅酶A作为一种前体分子起着重要的作用。这些药物和一些重要的类脂合成中，最关注的一个问题是前体分子的价格。上述分子物质的合成中，乙酰辅酶A的需求量巨大。目前乙酰辅酶A的合成方法主要有化学合成方法和酶法合成方法。化学方法合成乙酰辅酶A的缺点是使用有机溶剂，不环保，而且反应不专一性；而酶法合成乙酰乙酰A是目前发展的趋势，相比化学法，酶法合成乙酰辅酶A更加环保，反应条件更温和，反应专一性高。目前酶法合成乙酰辅酶A采用的酶是乙酰辅酶A合成酶(ACS)，但是该酶需要用到昂贵的辅因子ATP，限制了该酶的应用范围；同时现有的乙酰辅酶A合成酶(ACS)稳定性差，容易失活，造成酶的成本偏高，因此，常常需要将乙酰辅酶A合成酶(ACS)进行固定化，这增加了反应步骤。此外，常温菌柠檬酸菌(Citrobacter sp.S-77)来源的丙酮酸铁氧化还原蛋白酶可以使用TPP代替昂贵的ATP为辅因子，合成乙酰辅酶A，但是该酶热稳定性差，容易失活，需要对酶进行固定化，增加了合成乙酰辅酶A的操作步骤，而且该酶经过固定化后，其催化活性下降了64％，只有原来酶活性的36％，这增加了酶使用的成本。因此有必要探索新型的、环保的、低成本的、操作简单的可以规模化生产乙酰辅酶A的合成方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，如化学合成法使用有机溶剂，不环保，而且反应不专一性，乙酰辅酶A合成酶热稳定性差，容易失活，固定化后催化活性下降，增加酶使用成本等，本发明提供了一种酶法制备乙酰辅酶A的方法，利用丙酮酸铁氧化还原蛋白酶(PFOR)、底物丙酮酸钠，CoA，辅因子TPP和MgCl₂,甲基紫精，DTT，在无氧密闭反应瓶中进行反应得到乙酰辅酶A。

所述丙酮酸铁氧化还原蛋白酶是指将极端嗜热菌新阿波罗菌中的丙酮酸铁氧化还原蛋白酶基因克隆到大肠杆菌表达载体中，进行重组表达并纯化获得的重组酶丙酮酸铁氧化还原蛋白酶。

具体的，本发明按以下步骤进行：

(1)制备重组酶丙酮酸铁氧化还原蛋白酶：

用引物5’-TGTAAGGAGGTGCAATCGATG-3’和5’-CCCAAGCTTTCATCTGATCGGTTTGTCTTTTG-3’，从新阿波罗菌(Thermotoga neapolitana DSM 4359)基因组中扩增丙酮酸铁氧化还原蛋白酶基因(GenBank:NC_011978.1)，克隆到表达载体pET-20b(+)(Novagen,DarmstadtGermany)，构建成重组质粒pET-PFOR，导入E.coli BL21(DE3)中进行表达，并纯化出重组酶丙酮酸铁氧化还原蛋白酶；

(2)合成乙酰辅酶A：