[发明专利]重组突变体α1-抗胰蛋白酶及其制备和应用

说明书

本发明提供了一种新型的α1‑抗胰蛋白酶突变体，及生产和纯化这种新型重组突变体的方法。新型突变体是通过以蛋白质结构为依据的蛋白工程改造，设计出更加适合于医药应用的，结构上更稳定，并且能够抗氧化的候选蛋白药。本发明亦提供针对这种新的突变体的大肠杆菌表达，包涵体复性和纯化的方法。进一步，本发明亦提供对所纯化的候选药进行化学修饰的方法，以延长蛋白药在体内的半衰期，达到更佳的药效。

技术领域

本发明涉及到生产重组突变体α1-抗胰蛋白酶(AAT)多肽方法及在医疗领域的应用。

背景技术

早在1963年人们就发现遗传性肺气肿与α1-抗胰蛋白酶(AAT)有关[1]。20世纪70年代，研究发现了AAT的功能以及由遗传缺陷引起的肺部疾病的科学基础[2,3]。在生理上，嗜中性粒细胞是肺部侵入微生物病原体免疫应答的重要介质[4]，它可以畅通无阻地通过肺毛细血管。嗜中性粒细胞作为炎症反应的一部分，会释放大量的防御性分子，包括活性分子氧、阳离子肽、类花生酸和蛋白水解酶[5]。这些杀灭病原体的分子是人体防御的重要组成部分，然而这些防御性分子的不受约束的作用会导致严重的肺损伤。

人类白细胞弹性蛋白酶(HLE)作为正常炎症反应的一部分，是从嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒(azurophilic granules)释放的丝氨酸蛋白酶[6]。在正常稳态条件下，AAT作为HLE蛋白水解反应的重要抑制剂而防止肺泡基质的损伤。AAT是一种主要在肝脏中合成的52KD糖蛋白，但也在中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞中合成。AAT可被分泌到血浆中，但其主要作用部位是在肺实质[7]。除了HLE，AAT还抑制中性粒细胞释放到肺部的两种其他蛋白酶，即组织蛋白酶G(CatG)和蛋白酶3(Pr3)。CatG和Pr3也可以通过分解弹性蛋白和其他细胞外基质蛋白而导致肺损伤。AAT可以防止这种损害。不过HLE被认为是造成肺损伤的主要酶[8]。AAT的正常生物学功能对人体健康至关重要，因此被称为脉管组织的卫士[9]。

据估计，全世界具有AAT无效突变(PiZZ)的人群有253,404人[10]：欧洲119,594，美洲和加勒比地区91,490，非洲3824，亚洲32,154，澳大利亚4,126，新西兰2,216。PiZZ携带者患有遗传性肺气肿，可用AAT增强疗法治疗[10]。根据世界卫生组织的统计，在全球范围内，2015年慢性阻塞性肺病(COPD)造成约300万人死亡，在许多情况下COPD可以接受AAT治疗。然而市场上现有的从人血清中天然纯化的AAT药物只能满足不到10％的AAT遗传缺陷人群的治疗[11]。由于AAT供应有限，尚未对其在其他呼吸系统疾病(包括吸烟导致的肺气肿、囊性纤维化、肺动脉高压、肺纤维化和COPD)中的有益作用进行充分测试[12-14]。全世界估计至少有1.16亿的AAT基因突变携带者(PiMS和PiMZ：M，正常遗传Pi类型；S，低于正常；Z，低于S)和340万个缺失等位基因组合(PiSS，PiSZ，和PiZZ)[11,15]。这类人群对吸烟和环境污染等因素更敏感，更容易罹患COPD类疾病。

为了制备重组AAT，迄今已有许多利用不同表达系统来表达AAT的工作，包括细菌[16,17]、酵母[18]、植物培养[19-21]和转基因羊[22-25]。由于治疗遗传性肺气肿治疗需要大剂量(4-6g/周·患者)静脉注射[26]，或者每天高达250mg的雾化肺部给药[27])，所以生产AAT的基本要求是可扩大规模——每年需要百万公斤级的药用级别的AAT药物，以及成本控制——使病人负担得起。大肠杆菌表达法是生产重组蛋白质药物的最具成本效益的方法之一。然而，AAT在细菌中过度表达时倾向于形成不溶性包涵体，从而限制了可溶性表达的可伸缩性。

发明内容

天然α1-抗胰蛋白酶(AAT)是一个52kDa的糖蛋白，具有抗蛋白酶的作用，是嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、组织蛋白酶G和蛋白酶3等嗜中性粒细胞丝氨酸蛋白酶的生理抑制剂。AAT的主要功能是保护肺部在炎症发生时不受由蛋白酶造成的损伤。AAT的遗传或获得性缺陷会导致遗传性肺气肿、COPD等严重疾病。由其生物功能所决定，天然AAT较不稳定并很容易被氧化。但为了使AAT能够作为药物用于临床治疗，则需要增加其稳定、抗氧化性和体内半衰期。