[发明专利]重组突变体α1-抗胰蛋白酶及其制备和应用

权利要求书

1.一种α1-抗胰蛋白酶突变体，是具有活性的F51L/M351V/M358V三突变体的化学修饰体，所述具有活性的F51L/M351V/M358V三突变体的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No：1在N-末端截掉1～10个氨基酸残基后的序列，所述化学修饰体是在F51L/M351V/M358V三突变体的Cys232位点上或N-端位点上具有化学修饰，所述化学修饰是棕榈酸化修饰。

2.如权利要求1所述的α1-抗胰蛋白酶突变体，其特征在于，所述在N-末端截掉1～10个氨基酸残基后的序列是指：序列表中SEQ ID No：1截掉第1-5位氨基酸残基后的序列，或序列表中SEQ ID No：1截掉第1-10位氨基酸残基后的序列。

3.权利要求1或2所述α1-抗胰蛋白酶突变体的制备方法，包括以下步骤：

1)将所述突变体的编码基因构建到表达载体上，通过表达宿主表达该突变体蛋白；

2)收集并纯化含有所述突变体蛋白的包涵体；

3)用溶解缓冲液溶解包涵体，然后通过复性缓冲液使突变体蛋白复性；

4)纯化出复性的突变体蛋白。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)以大肠杆菌为表达宿主过表达所述突变体蛋白；在步骤3)中所述溶解缓冲液为高浓度的尿素缓冲液或盐酸胍缓冲液，所述复性缓冲液为包含甘油、蔗糖和/或聚乙二醇的Tris缓冲液。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述复性缓冲液还包含去污剂，所述去污剂选自下列物质中的一种或多种：吐温-20、吐温-80、脱氧胆酸钠、胆酸钠和氧化三甲胺。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)通过下述方法一至方法四中的一种实现：

方法一：a)用第一溶解缓冲液溶解包涵体，所述第一溶解缓冲液包含6-8M尿素，0.01-0.1M Tris，1mM甘氨酸，1mM EDTA，10-100mMβ-巯基乙醇，pH7-10，获得溶解的多肽原溶液；b)用第二溶解缓冲液调节溶解的多肽原溶液的A₂₈₀到1.0-4.0，所述第二溶解缓冲液包含6-8M尿素，0.1-0.1M Tris，1mM甘氨酸，1mM EDTA，1-10mMβ-巯基乙醇，1-10mM二硫苏糖醇，1mM还原型谷胱甘肽，pH8-10；c)将上述b)所得溶液加至10-50倍体积的复性缓冲液中快速稀释，此复性缓冲液包含1-20mM Tris，pH 7-10及下述I)～V)中的任何一种：I)5％至30％甘油，II)5％至40％蔗糖，III)20％甘油和20％蔗糖，IV)10％甘油和10％蔗糖，V)5％至10％聚乙二醇；d)将稀释后溶液的pH降低至7.0-8.5，由此产生复性的所述突变体蛋白；

方法二：a)用溶解缓冲液溶解包涵体，所述溶解缓冲液包含6-8M尿素，0.01-0.1MTris，1mM甘氨酸，1mM EDTA，1-10mMβ-巯基乙醇，1-10mM二硫苏糖醇，1mM还原型谷胱甘肽，pH8-10，获得溶解的多肽溶液；b)将该多肽溶液加至10-50倍体积的复性缓冲液中快速稀释，此复性缓冲液包含1-20mM Tris和5-30％甘油，pH8-10；c)将稀释后溶液的pH缓慢降低至7.0-8.5，由此产生复性的所述突变体蛋白；

方法三：a)用溶解缓冲液溶解包涵体，所述溶解缓冲液包含6-8M尿素，0.01-0.1MTris，1mM甘氨酸，1mM EDTA，1-10mMβ-巯基乙醇，1-10mM二硫苏糖醇，1mM还原型谷胱甘肽，pH8，获得溶解的多肽溶液；b)将该多肽溶液加至10-50倍体积的复性缓冲液中快速稀释，此复性缓冲液包含1-20mM Tris和5-30％甘油，pH8；c)将稀释后溶液的pH缓慢降低至7.6，由此产生了复性的所述突变体蛋白；

方法四：a)用溶解缓冲液溶解包涵体，所述溶解缓冲液包含6-8M尿素，0.01-0.1MTris，1mM甘氨酸，1mM EDTA，1-10mMβ-巯基乙醇，1-10mM二硫苏糖醇，1mM还原型谷胱甘肽，pH7.6，获得溶解的多肽溶液；b)将该多肽溶液加至10-50倍体积的复性缓冲液中快速稀释，此复性缓冲液包含约20mM Tris和10％甘油，pH7.6，由此产生复性的所述突变体蛋白。