[发明专利]大肠杆菌中具有产氢功能基因的载体pET32a-fdhF-1及其构建和应用

说明书

大肠杆菌中具有产氢功能基因的载体pET32a‑fdhF‑1及其构建和应用，涉及基因工程技术领域。pET32a‑fdhF‑1基因载体为包含有大肠杆菌BL21甲酸脱氢酶fdhF基因的pET32a质粒。其构建是通过设计引物扩增大肠杆菌BL21的甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase H)的fdhF基因片段，并通过T4 DNA连接酶将其连接到酶切后的pET32a载体中，命名为pET32a‑fdhF‑1，进行基因测序，验证基因的完整性。将pET32a‑fdhF‑1质粒转化到大肠杆菌中，在产氢培养基中进行培养产氢。转入载体pET32a‑fdhF‑1能提高大肠杆菌产氢效率。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种产氢功能基因载体 pET32a-fdhF-1及其构建和应用。

背景技术

目前化石能源逐渐减少，而在新的能源领域中，氢能作为一种无污染的清洁能源及能源载体，近年来其开发与利用技术得到工业化国家的高度重视。当下氢气生产主要有化石能源转化，水的分解，以及生物制氢三种方式。前两种应用广泛，但污染环境且不具有可持续发展性。生物制氢具有安全、低成本、环境友好以及对可再生物质资源合理利用的优点，若能够广泛应用，对环境保护会有重要的意义。由于大肠杆菌相对其他可产氢微生物培养成本低且可实现性强，因此是发展微生物产氢的最佳选择。野生大肠杆菌不产氢或产氢较少，已有的通过基因工程改造的大肠杆菌不稳定且产氢效率低下，亟待通过人工引入外来基因使其产氢效率有所提高，以满足人类发展氢能源的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一个产氢功能基因载体pET32-fdhF-1及其构建方法。其能够应用于大肠杆菌BL21中，能使大肠杆菌的产氢效率得到提高。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供一种产氢功能基因载体pET32a-fdhF-1，其为包含有大肠杆菌的甲酸脱氢酶基因fdhF的pET32a-fdhF-1质粒。(说明：将大肠杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF 进行克隆用于提高产氢量为本发明首创，选用pET32a为载体表达甲酸脱氢酶基因fdhF 也为本发明的创新)

本发明还提供了产氢功能基因载体pET32a-fdhF-1的构建方法，主要通过使用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切PCR产物及质粒，再使用T4DNA连接酶连接二者。

(说明：为提高酶切效率，可以先将PCR产物亚克隆到pCloneEZ-TOPO载体，然后再从转化的细菌中提取质粒并酶切。)

具体操作过程包括以下步骤：(1)DNA片段制备：结合表达载体pET32a上的酶切位点Nde I及XhoI，设计大肠杆菌中甲酸脱氢酶基因fdhF的引物，并使用高保真 DNA聚合酶PCR反应扩增fdhF基因。将PCR产物亚克隆到pCloneEZ-TOPO载体，然后再从转化的细菌中提取质粒并用Nde I及XhoI酶切，切胶回收fdhF基因片段。

(2)线性化载体制备：使用pET32a为载体，使用Nde I及XhoI双酶切获得线性化载体。

(3)连接反应：通过T4DNA连接酶，将准备好的线性化载体和fdhF基因片段连接起来，得到重组载体。

(4)转化：将构建好的重组载体转入感受态大肠杆菌DH5α中。

(5)阳性转化子的鉴定：挑取克隆菌，使用扩增fdhF基因所用的引物，进行菌落PCR反应，通过电泳进行鉴定，确定阳性转化子后，再提取质粒、测序。

本发明还提供产氢功能基因载体pET32a-fdhF-1的应用：将pET32a-fdhF-1 质粒转化到大肠杆菌BL21中，在产氢培养基中培养进行产氢。(说明：选用大肠杆菌 BL21为宿主菌，将构建的质粒转化到此菌中用于产氢反应，也是本发明的创新。)