[发明专利]一种润肠功能的富硒酵母及其制备方法

说明书

本发明涉及一种润肠功能的富硒酵母及其制备方法。具体地，本发明涉及可以分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母及其构建方法与其润肠作用。本发明利用酿酒酵母交配因子(MF)α的分泌信号肽序列与铜锌超氧化物歧化酶(hCu/Zn‑SOD)cDNA融合构建了分泌表达载体，实现hCu/Zn‑SOD在酿酒酵母中的克隆和分泌表达，所构建的工程菌可以在人体温范围内直接分泌表达有活性的外源性hCu/Zn‑SOD，表达产物可直接应用于医药、食品保健等领域，发挥其润肠等功能。本发明酵母工程菌株的成功构建为开发hCu/Zn‑SOD的基因工程产品奠定了良好的基础，应用前景广阔。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及可以分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母及其构建方法与其在制备活性润肠产品中的应用。

背景技术

超氧化物歧化酶(SOD)是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，按其结合的金属离子可分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种，它们主要催化超氧化物阴离子自由基发生歧化反应，生成氧和过氧化氢。超氧化物歧化酶可以防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，还可预防衰老，对一些疾病如肿瘤、炎症及自身免疫疾病等具有良好的疗效。通过研究寄生虫及宿主体内SOD的含量、结构及功能有助于确立寄生虫免疫诊断指标和寻找特异性抑制虫体相关酶的药物。其中，Cu/Zn-SOD(SOD1)分布最广，占总SOD的90％以上，它是一种普遍存在的酶，在家族性肌萎缩性侧索硬化症(FALS)、帕金森病(PD)、登革热、癌症、Down’s综合症、白内障和多种神经紊乱综合症中具有重要的生理学意义和治疗潜力。

天然SOD来源有限，且具有异体蛋白免疫原性，外源SOD不易被人体接受等，使其在应用方面受到很大限制，用基因工程技术制备的SOD是广开酶源、降低成本和获得无抗原性的人源 SOD的有效途径。目前，国外对SOD进行了一系列的基础研究、应用开发和临床试验，主要包括SOD的纯化、理化性质、临床疗效等方面的研究目前，大肠杆菌表达的SOD经过纯化主要用于一些药品中，如果将其应用在食品保健产品中，SOD产品存在不易保存、容易失活或者活性较低的问题。据检索，还没有将可表达SOD的酿酒酵母直接应用于食品的报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有润肠作用的富硒酵母及其制备方法，所构建的工程菌可以在人体温范围内直接分泌表达有活性的外源性hCu/Zn-SOD，表达产物可直接应用于医药、食品保健等领域，发挥其润肠等功能。

本发明的技术方案如下：

本发明的其中一个目的是提供一种适于在酿酒酵母中分泌表达超氧化物歧化酶的SOD-酿酒酵母重组表达载体。

所述重组表达载体为携带酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因的重组酿酒酵母分泌表达载体。

用于构建重组酿酒酵母分泌表达载体的出发载体可为任意一种可在酿酒酵母中分泌表达外源基因的真核表达载体，如pJK3、pMD18-T、pUC19、pET22b(+)等，优选为pUC19。

以pUC19为出发载体构建的重组酿酒酵母分泌表达载体命名为pUC19-MS。其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

所述重组酿酒酵母分泌表达载体pUC19-MS的构建方法，可包括以下步骤：

1)扩增酿酒酵母MF-α信号肽基因：以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株INVSC1 的菌体裂解液为模板，在引物T1：

5'-GGGGTACCATGAGATTTCCTTCTATTTTTACTGC-3'(含KpnI酶切位点)和T2：

5'-CGGGATCCTCTTTTATCCAAAGAAACACCT-3'(含BamHI酶切位点)的引导下PCR扩增MF-α信号肽基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；