[发明专利]一种润肠功能的富硒酵母及其制备方法

权利要求书

1.一种用于在酿酒酵母中分泌表达超氧化物歧化酶的重组表达载体，是携带酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因的重组酿酒酵母分泌表达载体；用于构建重组酿酒酵母分泌表达载体的出发载体可为任意一种可在酿酒酵母中分泌表达外源基因的真核表达载体，如pJK3、pMD18-T、pUC19、pET22b(+)等，优选为pUC19；以pUC19为出发载体构建的重组酿酒酵母分泌表达载体命名为pUC19-MS。

2.根据权利要求1所述的重组酿酒酵母分泌表达载体，其特征在于：所述重组酿酒酵母分泌表达载体pUC19-MS的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

3.根据权利要求2所述的重组酿酒酵母分泌表达载体，其特征在于：所述重组酿酒酵母分泌表达载体pUC19-MS的构建方法，包括以下步骤：

1)扩增酿酒酵母MF-α信号肽基因：以酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌株INVSC1的菌体裂解液为模板，在引物T1：5'-GGGGTACCATGAGATTTCCTTCTATTTTTACTGC-3'(含KpnI酶切位点)和T2：5'-CGGGATCCTCTTTTATCCAAAGAAACACCT-3'(含BamHI酶切位点)的引导下PCR扩增MF-α信号肽基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；

2)扩增hCu/Zn-SOD基因：提取人胃组织总mRNA，然后RT-PCR扩增出其总cDNA作为PCR模板，在引物I1：5'-CGGGATCCGCGACGAAGGCCGTGTGCGTGCT-3'(含BamHI酶切位点)和I2：5'-GCTCTAGAGAATGTTTATTGGGCGATCC-3'(含XbaI酶切位点)的引导下PCR扩增hCu/Zn-SOD基因，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；

3)构建克隆载体pUC-MS：将酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因连接入克隆载体pUC19中，得到携带酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因的克隆载体pUC-MS，hCu/Zn-SOD融合基因的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

4)构建重组酿酒酵母分泌表达载体：将克隆载体pUC-MS与载体pUC19经KpnI和XbaI进行双酶切后，将酿酒酵母MF-α信号肽基因和hCu/Zn-SOD基因连接入酿酵母分泌型表达载体pUC19中，得到用于分泌表达hCu/Zn-SOD的重组酿酒酵母分泌表达载体pUC19-MS，其核苷酸序列如序列表中序列4所示。

4.一种可分泌表达超氧化物歧化酶的工程酿酒酵母，是以酿酒酵母转化有权利要求1-3中任一项所述重组酿酒酵母分泌表达载体，优选pUC19-MS，得到的重组酿酒酵母；所述酿酒酵母为适于蛋白表达的酿酒酵母菌株，如INVSC1；所述转化方法为醋酸锂法、热激法、电转化法、接合转化法PEG介导的原生质体转化法等；以INVSC1为出发菌株，构建的转化有重组酿酒酵母分泌表达载体pUC19-MS的工程酿酒酵母为pUC19-MS/INVSC1。

5.一种在酿酒酵母中分泌表达超氧化物歧化酶的方法，包括在培养基中发酵权利要求4所述工程酿酒酵母，得到高活性的超氧化物歧化酶的过程。

6.根据权利要求5所述的分泌表达方法，其特征在于：所述培养基为YPD半乳糖诱导培养基，是由以下组分组成的水溶液：按重量1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的浓度为20g/L；所述发酵温度为30℃，诱导时间为24-48小时。

7.权利要求4所述工程酿酒酵母在制备用于润肠产品中的SOD活性基质中的应用。

8.一种SOD活性基质，将权利要求4所述工程酿酒酵母(例如pUC19-MS/INVSC1)在YPD半乳糖诱导培养基里进行30℃培养，在该酿酒酵母生长至对数期(约16-18h，OD:1.3-1.5)，经Westernblot验证SOD表达，得到SOD活性基质；所述YPD半乳糖诱导培养基为由以下组分组成的水溶液：按重量1％酵母膏，2％蛋白胨，2％葡萄糖；半乳糖的浓度为20g/L。