[发明专利]一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法

说明书

本发明公开了一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法，包括如下步骤：S1：无菌苗的获得:将种子置于37℃‑40℃恒温摇床上震荡浸泡24‑36h；在无菌超净台上，用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3次，10％NaClO溶液灭菌12‑15min，无菌水彻底冲洗6次，将种子播种培养；S2：茎段的伸长以及获得；S3：茎段的诱导及伸长；S4：生根培养；S5：炼苗及移栽。本发明的高效组织培养和植株再生方法，可摆脱外界条件的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的黄粱木组培幼苗；与已经报道的以下胚轴、带腋芽的茎段、萌芽条作为外植体构建再生体系相比，该方法不仅能满足市场对种苗的需求，并且可以通过转基因研究对黄粱木种质资源进行改良和创新，为黄粱木种质资源可持续利用奠定基础。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及黄粱木茎段为材料诱导愈伤和愈伤再生的方法。

背景技术

黄梁木(Neolamarckia cadamba)是一种有独特经济价值的茜草科(Rubiaceae)团花属植物，其主要生长在南亚和东南亚，最近已被引进到哥斯达黎加，波多黎各，南非，苏里南，委内瑞拉等热带和亚热带国家，而在中国主要分布于广东、广西、云南、福建等地区。它是一种典型的多功能植物，其材质好，木材淡黄色，纹理通直，可作家具、建材、人造纤维、胶合板等原料；花是良好蜜源，果实可以食用，树皮、茎、根提取物可用做香料精及治疗蛇咬伤、糖尿病、发烧、贫血、霍乱等多种疾病；枝叶可做家畜饲料；黄梁木全身是宝，被人们誉为“宝石之树”和“奇迹树”，是一种极具发展前景的乡土阔叶树种。

目前黄粱木主要是通过播种育苗繁育，但种子不耐贮藏，一年后种子活力就下降，随着贮藏时间延长，种子萌发率越来越低，而且这种方式获得的幼苗生长慢，高度参差不齐，个体分化大，育苗周期长。另外，黄梁木植株的嫩枝和顶芽对低温较敏感，在12h的-2℃低温下就产生冻害甚至死亡，严重影响植株生长和树干的通直度，所以，黄梁木在国内仅分布于中国华南地区。为了使黄粱木的分布更广，国内外开始对提高黄粱木种苗繁殖率进行深入研究，想通过组织培养的方式可以解决黄粱木抗寒性差问题，随着黄粱木全基因组测序的完成，黄粱木育种也必将进入分子育种时代，黄粱木遗传转化体系的构建显得尤为重要，而高效的再生体系是遗传转化体系构建的前提。

关于黄粱木的组织培养，国内外已有几篇成功报道，主要以带腋芽的茎段、萌芽条作为外植体分别诱导出腋芽和顶芽,进而增殖、生根和移栽，但黄梁木茎段和萌芽条的髓部均为疏松的填充物，极易带有病菌，很难彻底消毒，且通过茎段和萌芽条外植体获得无菌苗的机率极低，效率不高，技术很不稳定，所以，利用黄梁木无菌茎段为外植体，通过组织培养技术建立稳定、可靠的植株高效再生技术体系，不仅能满足市场对种苗需求，而且可以通过转基因途径对黄梁木种质资源进行改良和创新，为黄梁木种质资源可持续利用奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种以黄粱木茎段为外植体的操作更简便、取材更广泛的高效的黄粱木组培繁育方法，利用该方法能够在短期内快速获得大量优质的黄粱木种苗。

本发明所采用的技术方案：一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1：无菌苗的获得：将种子置于37℃-40℃恒温摇床上震荡浸泡24-36h；在无菌超净台上，用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3次，10％NaClO溶液灭菌12-15min，无菌水彻底冲洗6次，将种子播种培养；

S2：茎段的伸长以及获得：种子培养7d开始萌芽，15-25d后生长成无菌苗，把无菌苗切断接种培养，培养15-28天后，切取茎段作为外植体；

S3：茎段的诱导及伸长：将外植体诱导愈伤，接种时茎段垂直插入培养基；培养15-25d后，茎段上开始由黄绿色愈伤变成绿色芽点时，将外植体诱导不定芽伸长；

S4：生根培养：待不定芽伸长到3-4cm时，切取不定芽进行诱导生根；