[发明专利]一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽、其制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽、其制备方法及应用。该技术方案首先基于噬菌体展示肽库技术，以抗ENR单克隆抗体为靶标，从噬菌体随机展示七肽库中淘选得一种序列为GKPYITW的ENR抗原模拟表位。本发明分别给出了通过噬菌体扩增手段、通过基因重组手段制备该抗原模拟表位的方法。本发明围绕该抗原模拟表位的免疫结合特性，基于酶联免疫吸附法、胶体金免疫层析法、荧光微球免疫层析法设计了具体的检测方法。该抗原模拟表位具有与天然ENR分子相似的免疫反应特性，可以替代耐药性强且价格昂贵的ENR标准品用于ENR的免疫学检测，检测结果准确、灵敏度高。

技术领域

本发明涉及噬菌体展示肽库技术领域，具体涉及一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽、其制备方法及应用。

背景技术

恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)，属于氟喹诺酮类的代表性药物，由于使用方便、成本低廉、疗效显著，广泛用于动物养殖领域细菌、病毒感染性动物疾病的治疗和控制。在养殖业中，一些养殖者不遵循动物休药期，通过滥用ENR 来获取更大的经济利益，以致使ENR在动物源性食品中成为一个普遍现象。大量研究表明，长期食用含有ENR残留的食品能够造成人的耐药性，引起消化系统、神经系统和泌尿生殖系统等系统的不良反应以及过敏反应。近年来我国畜禽产品由于该类药物残留超标屡遭出口限制时有发生。因此，加强ENR抗生素残留高灵敏快速检测研究显得尤为重要。

目前，食品中ENR的检测方法主要有高效液相色谱、气相色谱、高效液相色谱串联质谱、气相色谱串联质谱和免疫分析等方法，免疫分析方法以其简单方便、灵敏度高、成本较低等特性在ENR的检测中得到了广泛的应用。但是，在实施免疫分析检测的过程中，必须使用ENR标准品为基础原材料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，ENR不仅导致人和动物易产生耐药性现象，而且价格昂贵，对检测人员的身体健康和生态环境造成极大的危害。近年来研究人员采用抗原模拟表位成功替代小分子抗原进行了免疫学检测，在这种情况下，如果能获取一种与天然ENR具有相似免疫反应特性的替代性无毒物质，则有望在针对ENR 的免疫检测方法中避免使用大量的ENR标准品，以期降低检测成本同时提升安全性。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽，以解决现有技术中缺乏一种与恩诺沙星具有相似免疫反应特性、能替代其作敏感型免疫检检测元件的技术问题。

本发明同时提供了上述模拟恩诺沙星的抗原表位肽的制备方法，以解决其制备方法不明确的技术问题。

本发明同时提供了上述模拟恩诺沙星的抗原表位肽在具体免疫检测方法中的应用，以解决现有技术中的常规检测方法未针对该抗原表位肽的免疫学性质进行适应性匹配，因而难以获得最佳检测效果的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽，其氨基酸序列为：GKPYITW。

一种编码上述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列为： GGTAAGCCTTATTTAACTTGG。

本发明同时提供了上述抗原表位肽的一种制备方法，包括以下步骤：将具有 ENR抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738大肠杆菌的培养液中， 37℃150rpm振荡培养4.5h；将培养物转入另一离心管中，4℃12000g离心 10min，将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置过夜；4℃12000g离心15min，沉淀重悬于1mlTBS中，4℃14000rpm离心5min；上清转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃ 14000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于200μl TBS中。在该制备方法中，所述具有ENR抗原模拟表位的噬菌体，可以是通过以下淘选方法获得的：