[发明专利]一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽、其制备方法及应用

权利要求书

1.一种模拟恩诺沙星的抗原表位肽，其氨基酸序列为：GKPYITW。

2.一种编码权利要求1所述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列为：GGTAAGCCTTATTTAACTTGG。

3.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：将具有恩诺沙星抗原模拟表位的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738大肠杆菌的培养液中，37℃150rpm振荡培养4.5h；将培养物转入另一离心管中，4℃12000g离心10min，将上清上部80％体积的部分转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4℃静置过夜；4℃12000g离心15min，沉淀重悬于1ml TBS中，4℃14000rpm离心5min；上清转入另一离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃14000rpm离心10min；弃上清，沉淀重悬于200μl TBS中。

4.权利要求1所述抗原表位肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)PCR扩增序列为GGTAAGCCTTATTTAACTTGG的DNA片段，分别采用ACC65I和Eag I酶对该DNA片段和pMAl-pIII表达载体进行双酶切；将质粒pMal-PIII和该DNA片段以1:10的摩尔比混匀，于16℃水浴连接12h，取10μl连接产物加至100μl感受态细胞TB1中，充分混匀；冰浴30min后，42℃水浴热激90s，立即冰浴5min后补加600μl LB液体培养液，37℃200rpm培养1h，10000rpm离心1min，吸去上清留取约200μl，涂布于LB-A固体培养基中，37℃过夜培养，得到阳性克隆；

2)将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5ml LB-A、0.2％蔗糖中，37℃220rpm振荡培养过夜，将过夜培养物按1％(v/v)的接种量接种于50ml的LB-A、0.2％蔗糖培养基中，37℃220rpm振荡培养，当培养物细菌浓度达到OD600nm值为0.6时，向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM，220rpm振荡培养，将PEG溶液于4℃4000g离心20min收集菌体沉淀，弃上清；重悬细胞于400ml含有30mM Tris-HCl、20％蔗糖且pH为8.0的溶液中，加入EDTA至

1mM，室温下震荡10min，8000g 4℃离心20min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mMMgSO4，冰上震荡10min，4℃8000g离心20min，保留上清，向上清液中加入8ml pH为7.4、浓度为1M的Tris-HCl，获得恩诺沙星抗原模拟表位-MBP融合蛋白。

5.权利要求1所述抗原表位肽作为酶联免疫吸附法的竞争抗原用于检测食品中恩诺沙星的应用。

6.权利要求1所述抗原表位肽作为酶联免疫吸附法的固相抗原用于检测食品中恩诺沙星的应用。

7.权利要求1所述抗原表位肽作为胶体金试纸的检测线用于检测食品中恩诺沙星的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于包括以下步骤：

用10mM PBS缓冲液稀释具有恩诺沙星抗原模拟表位的噬菌体至2.0×1011pfu，取0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三维点喷仪分别喷点于硝酸纤维素膜上，作为试纸条的检测线和质控线，两线间隔约为7mm，37℃干燥12h，备用；用K2CO3调1ml胶体金溶液至pH值为8.2，用蒸馏水稀释抗恩诺沙星单克隆抗体至0.04mg/ml，然后缓慢加入胶体金溶液中，边滴边搅拌，搅拌反应1h后，加入100μl 1％PEG至溶液中，继续搅拌30min；加入100μl 10％BSA溶液，搅拌30min，4℃8000rpm离心30min，弃上清，100μl重悬液重悬沉淀，4℃保存备用；将胶体金标记抗体复合物稀释，用XYZ三维点喷仪将稀释后的复合物喷涂于结合垫上，30℃干燥2h，备用；将硝酸纤维素膜、胶体金结合垫、样品垫和吸水纸依次组装在PVC底板上，用切刀切割成4mm宽的试纸条装入检测卡中，备用；将80μl样品提取液加入试纸条加样孔中，10min后观察检测结果。