[发明专利]一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法

说明书

本发明公开了一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，是以萤火虫荧光素酶Fluc基因为目的基因，分别构建多角体polh启动子和p10启动子控制的含有1‑3个基因拷贝数的重组杆状病毒，再感染SF9细胞系，感染后收集细胞检测萤火虫荧光素酶的活性。本发明的有益效果为：本发明提供的方法，经过检测发现，与未改造的杆状病毒相比，萤火虫荧光素酶基因表达量明显增加2‑5倍，有效提高了外源基因在杆状病毒系统中的表达量，适用于生产具有天然活性的蛋白质，其具有十分重要的意义，为利用杆状病毒多基因表达系统进行生产提供了一种新的构建重组病毒策略，实现了外源基因在杆状病毒多基因表达系统中的高效表达。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法。

背景技术

目前，杆状病毒表达系统在药物研发、疫苗生产、基因治疗、重组杆状病毒杀虫剂等领域得到广泛应用。由于杆状病毒具有强大的多角体(polh)启动子和p10启动子，表达的外源蛋白经过修饰加工后具有良好的生物学活性，而且其基因组可以容纳较大的外源基因片段插入等，所以昆虫——杆状病毒表达系统已经成为公认的优良真核表达系统。近年来，利用重组杆状病毒生产的药物和疫苗都有成功上市的案例，例如杆状病毒表达系统生产的人乳头瘤病毒疫苗(Cervarix^TM，葛兰素史克)已经上市，并取得很好的免疫效果。

为了更好的利用杆状病毒表达系统生产外源蛋白，国内外许多学者致力于如何提高外源蛋白表达量的研究。研究人员一般通过抑制目的蛋白降解、优化启动子类型、合理调控目的基因转录以及通过活体昆虫而非培养细胞等技术手段对杆状病毒表达量进行优化。上述方法都能在一定程度上提高杆状病毒表达外源蛋白的表达量，但是目前杆状病毒中外源蛋白的表达量还未能达到理想的水平,因此如何提高外源蛋白的表达水平成为提高昆虫——杆状病毒表达系统效率的核心问题。

理论认为，病毒基因组中整合的外源基因拷贝数与其表达量会遵循剂量效应，即随着外源基因拷贝数的增加，外源蛋白表达量会逐渐提高。有文献指出在杆状病毒表达系统中将人乳头瘤状病毒结构蛋白L1编码的外源基因增加到2拷贝时，病毒样颗粒表达量有了显著提高。但是，也有文献报道当多拷贝外源基因进行转录翻译时，各个基因以及启动子之间会相互影响，而导致外源蛋白的表达效率下降。但是，目前尚未有杆状病毒表达系统中外源基因拷贝数与其蛋白表达量之间关系的系统研究。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法。是将多个拷贝数的外源基因表达框通过常规克隆方法同时插入一个杆状病毒载体中，得到改造的杆状病毒来提高外源蛋白在杆状病毒表达系统中的表达量。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，是以萤火虫荧光素酶Fluc基因为目的基因，分别构建多角体polh 启动子和p10启动子控制的含有1-3个基因拷贝数的重组杆状病毒，再使用重组杆状病毒感染SF9细胞系，在感染后48小时到96小时收集细胞检测萤火虫荧光素酶的活性。

进一步的，上述的一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，其包括以下步骤：

1)萤火虫荧光素酶基因的获得：

以质粒pET28a-Fluc为模板，设计一对特异性引物BSFlucF和XhoFlucR，其中BSFlucF 引物添加有BamHI和SmaI酶切位点，XhoFlucR引物添加有XhoI酶切位点；然后利用PCR方法扩增得到Fluc基因并测序验证；

2)p10启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：