[发明专利]一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法

权利要求书

1.一种利用多拷贝基因共表达杆状病毒外源蛋白的构建和表达方法，其特征在于，是以萤火虫荧光素酶Fluc基因为目的基因，分别构建多角体polh启动子和p10启动子控制的含有1-3个基因拷贝数的重组杆状病毒，再使用重组杆状病毒感染SF9细胞系，在感染后48小时到96小时收集细胞检测萤火虫荧光素酶的活性；

包括以下步骤：

1）萤火虫荧光素酶基因的获得：

以质粒 pET28a-Fluc为模板，设计一对特异性引物BSFlucF和XhoFlucR，其中BSFlucF引物添加有BamHI和SmaI酶切位点，XhoFlucR引物添加有XhoI酶切位点；然后利用PCR方法扩增得到Fluc基因并测序验证；

2）p10 启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：

将测序正确的Fluc通过 SmaI 和 XhoI 进行酶切后连接进 pFBDM-IG的相同酶切位点，获得载体pFBDM-p10F-IG；然后将pFBDM-p10F-IG通过 PmeI 和 SpeI 酶切获得 p10F的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的 Bstz17I 和 SpeI 位点，获得pFBDM-2p10F-IG；最后将pFBDM-2p10F-IG通过 PmeI 和 SpeI 酶切获得 2p10F 的片段，克隆到pFBDM-p10F-IG的Bstz17I 和 SpeI 位点，获得pFBDM-3p10F-IG；

pFBDM-IG转移载体是在pFBDM原始载体的BstBI和PstI中插入IRES和GFP基因；

所述萤火虫荧光素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

所述杆状病毒为苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒；

所述目的基因表达通过杆状病毒感染细胞进行，所使用的细胞株为草地夜蛾细胞系SF9；

3）polh 启动子驱动的多拷贝外源基因转移载体的构建：

将测序正确的Fluc通过 BamHI 和 XhoI 进行酶切后连接进 pFBDM-IG的BamHI和SalI位点，获得载体pFBDM-polhF-IG；然后将pFBDM-polhF-IG通过 NruI 和 PstI 酶切获得polhF 的片段，克隆到pFBDM-polhF-IG的 Bstz17I 和 NsiI 位点，获得pFBDM-2polhF-IG；最后将pFBDM-2polhF-IG通过NruI 和 PstI酶切获得 2polhF 的片段，克隆到pFBDM-polhF-IG的 Bstz17I 和 NsiI位点，获得pFBDM-3polhF-IG；

4）Tn7位点的转座：

制备AcMultiBac/rSW106^-inv⁺asd^-感受态细胞，分别加入步骤2）或步骤3）中所构建的不同重组转移载体的质粒5μL，冰浴30min，42℃热激90s，冰上放置2min，然后加入800μL含有DAP的LB培养基，32℃ 200rpm恒温摇床上振荡培养6h，涂布含Kan/Tet/Spe/Gm/

DAP/IPTG/X-gal的固体LB平板上，32℃培养箱中培养24～48h，直至出现蓝白斑；挑取3～5个白斑于含Kan/Tet/Spe/Gm/DAP的LB培养液中32℃ 220rpm振荡培养，然后用Fluc特异性引物进行菌液PCR验证，验证正确的菌液保存备用；

5）重组菌液感染Sf9细胞获得重组杆状病毒：

将筛选的阳性重组菌液，感染Sf9细胞，感染方法为：用含8% FBS 的Grace's 培养基培养Sf9细胞于50 mL培养瓶中，当细胞生长70%到80%单层之间，吹下细胞，铺于24孔板中，28℃培养一夜；第二天用双无培养基轻轻清洗3次，洗掉完全培养基；将鉴定正确的含有重组杆状病毒穿梭质粒的大肠杆菌过夜培养后取1 mL 菌液到1.5 mL EP 管里，5000 rpm 离心3 min，倒掉上清，用PBS 重悬菌体，5000 rpm 离心3 min，重复洗2次，倒掉上清，加入1 mL双无培养基，在另外的装有500μL双无培养基的1.5 ml EP 管里稀释100倍、1000倍；将稀释成100倍、1000倍的500μL菌液与双无培养基混合液加入24孔板中，28℃孵育4 h，将菌液与双无培养基混合液吸出，加入500μL完全培养基；3d 后进行荧光检测观察以确定感染是否成功；将有荧光的细胞上清收集起来即为P1代重组病毒，将P1代重组病毒感染新的Sf9细胞得到P2代重组病毒；

6）萤火虫荧光素酶表达量的测定：

收集病毒感染的Sf9细胞，将Sf9细胞悬液交替地置于干冰和37℃水浴中反复冻融3次，4℃、10000g离心2 min，将上清液转移到另一离心管中备用；再利用荧光素酶检测试剂盒检测萤火虫荧光素酶的表达量即可。