[发明专利]一种低pH孵育病毒灭活的验证方法

说明书

本发明涉及一种低pH孵育灭活病毒的验证方法，选择指示病毒及其对应的宿主细胞；指示病毒扩增和纯化；病毒工作原液和样品的滴度测定；灭活病毒验证实验pH值的优化；低pH值孵育灭活病毒效果评估。本发明所提供的方法，能实现实验室摸拟基因工程药物生产工艺病毒灭活的全过程，优化了指示病毒的扩增、纯化工艺，使指示病毒工作原液滴度提高，pH值统一到7.0，质量稳定而益于后续操作，同时优化了低pH孵育的具体技术细节(如最优孵育pH值的确定，pH调节方式的优化等)，提高对常见的DNA病毒、RNA病毒、有包膜病毒和无包膜病毒灭活的有效性和实效性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体的，本发明涉及一种用于基因工程药物/生物制品生产工艺的低pH孵育病毒灭活的验证方法。

技术背景

随着21世纪生物技术的发展，动物源性组织、细胞、体液及基因工程真核细胞表达制备的生物制品逐渐增多，使用的人群不断扩大，加之动物源性产品原材料质量控制未引起足够重视，生产工艺又基本没有经过严格的病毒去除/灭活效果验证。因此，目前动物源性病毒感染人类的风险性极高，潜在病源性感染问题变得日益突出。其中动物组织来源制品由于动物本身健康检疫状况差，不同动物携带的病毒外源因子复杂多变，可控性因素尚不确定，对人体的潜在危害性较之经过系统鉴定和严格控制的基因工程真核细胞表达制品的风险性更高。而基因工程生物制品由于其原材料也易受到病毒污染(如来源于人类、动物的组织、血液、细胞等)，其生产过程中使用或添加了可能含有外源病毒因子的材料(如动物血清、胰酶等)，产品原辅材料的病毒质量控制未引起足够重视等原因，其相关风险也不容忽视。

迄今，全球销售额最高的6类生物技术药物，分别是肿瘤治疗药物、抗肿瘤坏死因子α药物、促红细胞生成素、胰岛素、β-干扰素和凝血因子。这6类生物药物除β-干扰素由大肠杆菌和酵母表达外，其余5类都是经哺乳动物细胞表达生产。动物细胞大规模培养是当前基因工程药物生产的主流方式。狂犬病毒、甲肝病毒等病毒灭活疫苗、乙型脑炎病毒等减毒活疫苗的生产也都必须在动物细胞系中扩增毒种。由于细胞是具有生命属性的活生命体，培养条件非常苛刻，生长周期比较长，易被无孔不入的微生物污染。尤其是细胞培养需加入很多培养基质，如培养基、血清、生长因子等，这些基质多种多样，多来自人源、动物源材料，使病毒潜在污染的风险明显增加。己证明血液制品中经常发现有HBV、HCV、HIV、HTLV等病毒的污染。为了提高基因工程药品的生物安性，在基因工程药物/生物制品生产工艺中增加病毒灭活步骤是必然趋势。

根据《药品注册管理办法》的要求，由人的、动物的组织或者体液提取的制品、动物源性单克隆抗体及真核细胞表达的重组制品，需增加病毒灭活工艺验证资料。因此国家食品药品监督管理局和药品审评中心先后于2002年和2005年发布《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》和《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》，要求基因工程药物/生物制品生产工艺必须包含病毒去除/灭活的有效工艺步骤，并对其方法和要点做了原则性的指导。其中，低pH孵育法就是一种有效的病毒灭活/去除工艺，可用于血液制品和其他药物/生物制品生产中。但这两个指导文件并没有对低pH孵育灭活病毒的验证实验的技术细节做出严格规格，尤其是pH的具体范围，检测参数，评估体系；指示病毒的选择等。本发明就是针对基因工程药物/生物制品生产工艺中病毒灭活与验证新技术的建立而提出的，具有实用性强，应用广泛的特点，建立了一套完备、高效的低pH孵育病毒灭活与验证技术体系。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种低pH孵育灭活病毒的验证方法。

为了达成上述的目的，本发明提供一种低pH孵育灭活病毒的验证方法，包括以下步骤：