[发明专利]一种低pH孵育病毒灭活的验证方法

权利要求书

1.一种低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)选择指示病毒及其对应的宿主细胞：选择伪狂犬病毒、鼠白血病病毒、水疱性口炎病毒、猪细小病毒为指示病毒；选择指示病毒相对应的宿主细胞，伪狂犬病毒对应的为猪肾细胞，鼠白血病病毒对应的为猫星型细胞，水疱性口炎病毒对应的为非洲绿猴肾细胞细胞，猪细小病毒对应的为猪肾细胞；

2)指示病毒扩增和纯化：常规扩增收样后超速离心换用新鲜无血清MEM培养基溶解，使其病毒滴度提高，pH值统一为7.0；

3)病毒工作原液和样品的滴度测定：采用TCID₅₀法或实时荧光定量RT-PCR法进行滴度测定；

4)灭活病毒验证实验pH值的优化：通过预实验确定了指示病毒最优的孵育pH以及pH值的最佳调节方式；

5)低pH值孵育灭活病毒效果评估：用阳牲对照的病毒滴度减去实时取样样品中的病毒滴度，获得不同取样时间点的病毒灭活定量数据(LRV，log/ml)，若该时间点的LRV≥4，则低pH孵育该时间的灭活工艺灭活病毒有效。

2.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，步骤2)所述指示病毒的扩增和纯化具体包括如下步骤：

将各宿主细胞分别接种在含有10％(v/v)FBS的MEM培养基的T75细胞培养瓶中，放置于37℃，5％CO₂培养箱中培养；

当宿主细胞汇合度达到80％-90％时，弃掉细胞上清，加入10^-4-10^-1稀释度的相应病毒液3ml，37℃吸附1～2h；

吸附结束后，弃掉病毒液于巴氏液中，用无血清的MEM培养基清洗细胞一遍，再用含有2％(v/v)FBS的MEM培养基培养36-48h左右，当宿主细胞发生80％以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮时，对细胞进行破碎，4℃3000g离心10min去除细胞碎片，收集上清，再用0.22μm滤器过滤后即为无菌的病毒种子原液；

取上述上清4℃，72,000g超速离心4h后，弃上清，沉淀用超速离心前原体积的1/5-1/2无血清MEM(pH＝7.0)溶解，使得病毒工作原液的pH统一调节为7.0。

3.如权利要求2所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，所述细胞的破碎方法为：当宿主细胞发生80％以上严重病变(CPE)但没有完全病变漂浮时，将整个T75瓶子冻入-70℃超低温冰箱，并在-70℃和37℃水浴反复冻融3次，每次冻融时间为30min-1h，且首次-70℃冰箱过夜；或者将宿主细胞直接用超声波进行破碎。

4.如权利要求1所述的低pH孵育灭活病毒的验证方法，其特征在于，其中步骤3)所述病毒工作原液和样品的滴度测定具体包括如下步骤：

根据低pH孵育法病毒灭活验证实验的需求分装病毒工作原液，同时以1ml/支分装并进行滴度测定；

对于CPE明显的病毒，采用TCID₅₀法进行滴度测定，而对于CEP不明显或滴度不高的病毒，采用实时荧光定量RT-PCR法测定滴度；

所述TCID₅₀法测定病毒滴度时，参照Reed-Muench方法，计算工作原液或样品病毒TCID₅₀；

所述实时荧光定量RT-PCR法测定病毒滴度时，通过比对标准曲线获得样品结果相应RNA拷贝数，以公式1000vRNA拷贝数/ml＝1pfu感染性滴度/ml换算工作原液或样品病毒滴度。