[发明专利]一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体、质粒、CIK细胞及MM病应用

权利要求书

1.一种共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：由CD8leader、BCMAscFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区、T2A自剪切区、IL-21表达区、T2A自剪切区、CD8leader、CD138scFv、CD8的铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激信号区、CD3ζ胞内信号区，依次串联构成；

BCMA scFv核酸人工序列为SEQ ID NO.3；

CD138scFv核酸人工序列为SEQ ID NO.10。

2.如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述CD8leader核酸人工序列为SEQ ID NO.2；

CD8铰链区核酸人工序列为SEQ ID NO.4；

CD8跨膜区核酸人工序列为SEQ ID NO.5；

4-1BB共刺激区核酸人工序列为SEQ ID NO.6；

CD3ζ信号传导区核酸人工序列为SEQ ID NO.7；

T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.8；

IL-21核酸人工序列为SEQ ID NO.9。

3.如权利要求2所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的核酸序列为SEQ ID NO.1。

4.如权利要求1-3任一项所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体，其特征在于：采用包括如下步骤的制备方法得到：

(1)分别按CD8leader核酸人工序列、BCMA scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A核酸人工序列、IL-21核酸人工序列、T2A核酸人工序列、CD8leader核酸人工序列、CD138scFv核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC57上得到pUC-MmCAR；

(2)将pUC-MmCAR进行双酶切，利用琼胶电泳将含有MmCAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的MmCAR DNA片段，即本发明所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。

5.一种质粒，其特征在于：所述质粒表达如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。

6.如权利要求5所述的一种质粒，其特征在于：所述质粒是将SEQ ID NO.1所示的融合基因片段插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到。

7.如权利要求5或6所述的一种质粒，其特征在于：所述质粒采用包括如下步骤的方法制备得到：将纯化的SEQ ID NO.1所示的 DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段，在连接体系为： 10×buffer：1μL；T4连接酶：1μL；SEQ ID NO.1所示的DNA片段：4μL；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μL的条件下过夜连接形成包含SEQ ID NO.1所示的DNA片段的慢病毒表达质粒。

8.CIK细胞，其特征在于：所述CIK细胞包含如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体。

9.如权利要求8所述的CIK细胞，其特征在于：所述CIK细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：首先将包含SEQ ID NO.1所示的DNA片段的慢病毒表达质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染 CIK细胞。

10.如权利要求1所述的共表达细胞因子IL-21的双特异性嵌合抗原受体在制备治疗多发性骨髓瘤病的药物中的应用。