[发明专利]一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法

说明书

本发明公开了一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法，涉及生物化学与分子生物学领域，步骤为：AGPase亚基蛋白Sh2和Bt2抗体的制备，AGPase亚基Sh2和Bt2抗体的特异性验证，授粉后15天、20天和27天玉米胚乳蛋白的提取，授粉后15天、20天和27天玉米胚乳磷酸化蛋白的富集，授粉后15天、20天和27天玉米籽粒磷酸化蛋白的检测和验证；本发明在制备好抗体后，结合Phos‑tag技术具有快速确定AGPase酶是否发生磷酸化的优势，并且不需要进行质谱，因而成本低。并且此方法只要有特异的相应蛋白抗体，具有推广到鉴定任意一种蛋白磷酸化的鉴定上，因此具有蛋白质磷酸化鉴定的广泛应用。

技术领域

本发明公开了玉米淀粉合成的关键酶腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）磷酸化的鉴定方法，涉及生物化学与分子生物学领域。

背景技术

蛋白质的磷酸化是指蛋白质在激酶的作用下，将ATP或GTPγ位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基（丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸）上的过程，是生物体内一种蛋白功能最有效的调节方式。同时，蛋白质的去磷酸化是在磷酸酶的作用下，去掉磷酸基团的过程。蛋白的磷酸化和去磷酸化是一个可逆的过程。蛋白质的磷酸化是目前研究最广泛的蛋白质翻译后修饰之一，在生物的生长发育过程中起着非常关键的作用，几乎参与了所有的生物学过程，比如生物的代谢调控、基因表达调控、对外界环境的响应和细胞的信号转导等过程。有研究表面在生物体内约有三分之一的蛋白质发生磷酸化修饰，因此蛋白质磷酸化鉴定对蛋白质的功能研究显得非常重要。

植物磷酸化蛋白质的富集与鉴定技术，是蛋白质磷酸化鉴定的关键。尽管在生物体内约有三分之一的蛋白质发生了磷酸化，但单个磷酸化蛋白在总蛋白中的占比比较小，相对含量比较低，因此直接鉴定单个蛋白的磷酸化比较困难。蛋白质磷酸化鉴定的前提是蛋白的分离与富集。目前对磷酸化蛋白质的富集技术主要有³²P放射性标记法、特异性抗体的免疫共沉淀、荧光染料染色和色谱分离等技术。

³²P放射性标记法。该方法利用³²P放射性同位素示踪标记蛋白质氨基酸上的磷酸基团，从而确定蛋白质磷酸化修饰的状态。Khan运用γ ³²P标记分析GA处理下水稻叶鞘中的磷酸化蛋白，鉴定出了44个发生磷酸化修饰的蛋白质。由于³²P放射性标记法具有放射性，实验操作要求高，因此今年报道较少。

免疫共沉淀法。该方法用磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸和磷酸化酪氨酸的特异抗体先后进行免疫共沉淀。蛋白质电泳分离蛋白质条带，胶上酶解后进行质谱分析鉴定。应用此方法Rush等富集了4中细胞的600多个酪氨酸磷酸化肽段，其中磷酸化位点约559个。因磷酸化丝氨酸和苏氨酸抗体的抗原决定簇较小，免疫共沉淀较为困难，且磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸和磷酸化酪氨酸的特异抗体获得较困难，因此报道也比较少。

荧光染料染色法（Pro-Q diamond phosphoprotein stain,Pro-Q DPS）。Pro-Q可高效地与磷酸化的氨基酸残基结合，采用蛋白质电泳技术对组织细胞总蛋白进行分离，然后用Pro-Q对蛋白胶进行染色，只有磷酸化蛋白才会结合Pro-Q而显色。Agrawa等鉴定出了在油菜籽粒发育不同阶段均发生磷酸化修饰的70个蛋白质。

固相金属离子亲和色谱(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)。1975年Porath提出该方法，其原理是磷酸化蛋白质会与IMAC硅脂柱上的固相化金属离子（Ga²⁺或 Fe³⁺）通过静电作用结合，然后先洗脱非磷酸化的杂志，最后富集和分离出磷酸化蛋白质。但该方法也存在多个磷酸化位点较难洗脱，有非特异结合等缺陷。