[发明专利]一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法

权利要求书

1.一种玉米AGPase磷酸化鉴定方法，其特征在于，包括如下顺序的步骤：

（1）通过基因克隆、原核表达载体构建、蛋白诱导表达和纯化及动物的免疫和血清的分离制备AGPase亚基蛋白Sh2和Bt2抗体；

（2）采用Western blot检测AGPase亚基Sh2和Bt2抗体的特异性；

（3）取材玉米高淀粉自交系08-641授粉后15天、20天和27天的玉米籽粒胚乳，在液氮中研磨至粉末，称重；以1g/3mL的比例加入相应的裂解液，并加入蛋白酶抑制剂，混匀，放置冰上30 min；在4℃下12000 rpm离心15 min，吸取上清于新的离心管，12000 rpm离心5 min，吸取上清；在3 mL反应液中加入6 µL的上清，测OD₅₉₅值，计算蛋白浓度；

（4）取上步获得的蛋白，利用Phos-tag小磁珠富集结合磷酸化蛋白，经过杂蛋白洗涤，洗脱磷酸化蛋白；

（5）利用制备的AGPase酶大小亚基抗体，将洗脱的磷酸化蛋白SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，大小亚基一抗杂交，曝光检测是否有条带判断AGPase酶大小亚基是否发生磷酸化；再取玉米胚乳裂解总蛋白10 µg，加碱性磷酸酶4 µL和2 µL 10×碱性磷酸酶buffer，加蛋白裂解液将总体积调为20 µL,37℃下反应3 h,再Phos-tag富集，洗脱磷酸化蛋白，电泳后转膜，牛奶封闭，Western blot杂交，验证Sh2和Bt2是否去磷酸化，从而证明是否发生磷酸化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，基因克隆时，Bt2基因所用上游引物序列为：‘5-CGGGATCCATGGACATGGCTTTGGCGTC-3’，下游引物序列为：‘5-CAGTCGACTCATATAACTGTTCCACTAG-3’；Sh2基因所用上游引物序列为：‘5-CGGGATCCATGCAGTTTGCACTTGCATTG-3’，下游引物序列为：‘5-CACTCGAGCTATATGACAGACCCATCGTTG-3’。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，基因克隆时，PCR反应程序为95℃、3 min，98℃、10 s、55℃、30 s、68℃、45 s、34个循环，72℃、10 min。