[发明专利]一种快速响应的新型一氧化氮的探针及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种快速响应的新型一氧化氮的探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针技术领域。NO在不同生理过程中的参与机制尚未被充分掲示且存在其供体释放不可控、在细胞及活体内的释放动力学复杂。因此，有必要开发快速响应的的NO探针。我们设计的XNO系列探针最大的特点就是反应速度快、反应后荧光有较大的增加。该探针具有较好的化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用,可以实现细胞水平NO含量的检测，并进一步应用帕金森疾病的前期检测研究，具有重大意义。

技术领域

本发明涉及一种快速响应的新型一氧化氮的探针及其制备方法和应用，属于有机荧光探针技术领域。

背景技术

一氧化氮(Nitric Oxide,NO)是体内重要的内源性小分子，在各种生命活动中发挥着重要作用。NO在不同生理过程中的参与机制尚未被充分掲示。一氧化氮供体是在此类研究中被广泛使用的一类小分子化学生物学工具。既有一氧化氮供体释放不可控、在细胞及活体内的释放动力学复杂。近年研究表明:在心血管中，一氧化氮对维持血管张力的恒定和调节血压稳定起着重要作用；硝酸甘油治疗心绞痛正是由于其在体内转化成NO，扩张血管；在免疫系统中，NO起杀伤细菌、病毒、肿瘤细胞的作用；在神经系统中，一氧化氮促进学习、记忆过程，并可调节脑血流。除此之外，NO还与皮肤正常生理功能的维护、性激素的调节、妊娠维持及分娩有关。

另外，NO是气体自由基，能够快速在细胞和组织中扩散且能和生物日标发生反应，因此，在生物体内检测一氧化氮的形成和迁移是十分困难的。目前，检测NO的方法主要有化学发光法、电化学法、荧光法、电子自旋共振光谱法和紫外一可见光谱法等，其中荧光法以其高选择性、高灵敏性、易于操作、实时性的优点，成为目前主要的研究方法。和其它方法相比，荧光检测可以和显微镜连用实现对细胞内和细胞外NO的成像，达到高的时空分辨率。

目前报道的NO荧光探针主要有两种不同的类型，分别是Nagano课题组开发的基于邻苯几胺结构的反应型一氧化氮探针和Lippard课题组报道的金属离子络合物一氧化氮探针邻苯二胺类反应型NO探针是基于PET(photoinduced electron transfer)原理，如2,3一二氨基蔡(DAN)、二氨基荧光素衍生物(DAFs)、二氨基罗丹明衍生物(DARs).氟硼毗咯甲基衍生物(BODIPY)和三碳著衍生物(DAC)等，这一类型探针具有灵敏度高、pH稳定并且可用于生物体内外的NO成像等优点。最近，Anslyn课题组开发出一类新型NO探针，探针设计原理为利用N一亚硝化成环反应构造新荧光团，并成功应用于细胞内外的NO荧光成像。但是，以上两类反应型NO探针必须在有氧条件下进行，实际参与反应的是NO的氧化产物NO+，因此不能准确定量检测细胞内一氧化氮浓度。

除此之外，含金属离子的NO探针是基于金属离子的顺磁效应，淬灭化合物的荧光，如Co(II),Fe(II)、Ru(II)、Rh(II)和Cu(II)配合物作为荧光打开的NO分子探针。其中基于Co(II)、Fe(II)、Ru(II)、Rh(II)的小分子探针普遍具有灵敏度不高、水溶性不好的缺点，因此限制了其在生物体内的应用。而铜离子络合物荧光探针成功解决了以上缺陷，具有检测限低、水溶性好，并应用到了生理环境中NO的检测，但是在生物体内，NO含量较低，这类探针在生物体内运用的时候，也会出现解离铜离子与结合铜离子的过程，并不能得到NO的准确含量。因此，为了解决以上问题，有必要开发新型一氧化氮探针。我们基于双光子萘酚荧光团，设计合成了一类快速响应的且有较大的斯托克斯位移的一氧化氮探针。该系列探针最大的特点就是反应速度快，利用反应后脱去苯酚的过程使得荧光有较大的增加。除此之外，探针吸收为特点是结合NO后脱去苯酚结构同时伴随巧光増强，方便对一氧化氮检测的动力学进行快速准确的监控，以及避免其他细胞内干扰具有很大的意义。另外，该探针具有较好的化学稳定性、生物兼容性和选择性等特点。激光共聚焦成像实验表明该探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用,可以实现细胞水平NO含量的检测，并进一步应用帕金森疾病的前期检测研究。

发明内容