[发明专利]一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法

说明书

本发明涉及生物酶活性测定技术领域，特别涉及一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法，包括：提取大肠杆菌质粒DNA；以质粒DNA为模板，PCR扩增出编码整合酶的整合子基因intI，并连接到表达载体pEASY‑E1上，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；PCR扩增出含整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC的DNA片段，并连接到载体质粒PUC19上，再转化到大肠杆菌DH5α；实时荧光定量PCR测定发生整和作用的拷贝数和未发生作用的拷贝数，计算整合效率，得整合酶活性大小。本发明分别构建带有整合酶的整合子基因intI的载体和含整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC的载体，体外测定并计算整合效率的大小，从而反应出整合酶活性大小，为研究大肠杆菌的耐药性提供理论基础。

技术领域

本发明涉及生物酶活性测定技术领域，特别涉及一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法。

背景技术

大肠杆菌是一种常见致病菌，由于抗生素的广泛持续的不当使用，导致大肠杆菌耐药株的大量出现，使临床对大肠杆菌病的治疗变得十分困难，有时甚至找不到可治之药，因此，近年来大肠杆菌的耐药性研究是热点。

整合子是一种运动性的DNA分子，具有独特结构可捕获和整合外源性基因，使之转变为功能性基因的表达单位，整合子可位于质粒、染色体或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移，整合子由3个部分组成：5′保守末端、3′保守末端和两者之间的可变区。5′保守末端是整合子的基本结构，包括编码整合酶的基因(intI)、整合子重组位点attI和整合子可变区启动子(Pant)。IntI属于酪氨酸整合酶家族的基因，催化基因盒在整合子重组位点attI和基因盒重组位点attC之间的整合和剪切。attC位点是一个不完全的反向重复序列,并含有一个可被整合酶识别的特异性整合位点。attC位点的长度为57～141bp,其最高度保守的特征是两个7bp的核心位点:核心位点GTTRRRY和与之相对称的反向核心位点RYYYAAC。可变区是插入编码某种功能的基因，如耐药基因，称为基因盒(gene cassette)，目前发现了超过80多种包括抗生素耐药在内的基因盒。基因盒总是以5′-3′的方向整合入整合子,使其可以在上游启动子Pant的作用下得以表达。被捕获的基因盒5′端与整合酶的att I结合而3′端与attC发生特异性整合。

2009年Julia E等认为整合酶整合有两种机制，第1种:整合酶从整合子(供体)中切除的一个基因盒形成一个共价闭环,然后它插入到另一整合子(受体)的attC位点；第2种:整合酶重组的供体和受体质粒,这些质粒都是由att I或者attC位点所形成的单一的共联体质粒,它们可由整合酶分成两个单独的质粒,一个质粒(受体)通过盒捕捉获得基因盒,另一质粒则失去。这两种机制它们所形成的最后的盒捕捉产物通过序列测定是没有区别的。2008年杨泽华博士做整合子捕获基因盒效率调控机制的研究，建立了测定整合子捕获基因盒效率的新方法。2010年魏取好博士做了细菌整合子捕获与表达耐药性基因盒调控机制的研究，建立了第1类整合子快速基因定位方法。

基因治疗工具酶phiC31在体外整合活性方法已经建立，HIV-1整合酶体外活性检测方法也已建立，但是细菌耐药性整合酶体外活性测定方法未见报道，细菌通过整合作用捕获外来的耐药基因，使细菌具有耐药及多重耐药性，造成细菌多重耐药性的传播，所以往往整合酶的活性能体现细菌耐药性的强弱，细菌通过整合子系统表达的整合酶，可使attI和attC位点发生整合作用而使同链的attI和attC位点之间的DNA序列长度发生改变，因此整合酶的整合效率的大小就反应了整合酶活性大小。为此，本发明提供了一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法。

发明内容

本发明提供一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法，测定了大肠杆菌整合酶整合过程中的整合效率，从而反应出整合酶活性大小，为研究大肠杆菌的耐药性提供理论基础。

本发明解决技术问题的方案是：一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法，包括以下步骤：

S1，提取大肠杆菌质粒DNA；