[发明专利]一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法

权利要求书

1.一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，提取大肠杆菌质粒DNA；

S2，以S1中的质粒DNA为模板，设计特异性引物，PCR扩增出编码整合酶的整合子基因intI，并连接到表达载体pEASY-E1上，得重组载体pEASY-intI，然后将pEASY-intI转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，得到转化大肠杆菌BL21（DE3）；所述特异性引物为：

上游引物Int-F：5’-ccggaattccggacgcgtctgacccccaa-3’，

下游引物Int-R：5’-cccaagcttgggcccgccgctgagatgc-3’；

S3，以S1中质粒DNA为模板设计与载体质粒PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基的特异性引物，PCR扩增出含整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC的DNA片段，将PCR扩增所得DNA片段连接到载体质粒PUC19上，得重组载体PUC19-attI-attC，并将载体PUC19-attI-attC转化于大肠杆菌DH5α中，得到转化大肠杆菌DH5α；所述特异性引物为：

上游引物attIF：5’-tgatgttatggagcagcaacg-3’，

下游引物attCR：5’-acctaacgtttgacatgagggg-3’；

S4，将S2中的转化大肠杆菌BL21（DE3）与S3中的转化大肠杆菌DH5α过夜共培养，用实时荧光定量PCR测定发生整合作用的拷贝数A和未发生整合作用的拷贝数B，按公式C=A/(A+B)计算整合效率C；或者分别提取S2中的转化大肠杆菌BL21（DE3）和S3中的转化大肠杆菌DH5α的质粒，并在Tris-HCl、NaCl、EDTA、甘油混合反应体系中加热，用实时荧光定量PCR测定发生整合作用的拷贝数A1和未发生整合作用的拷贝数B1，按公式C1=A1/(A1+B1)计算整合效率C1；其中，实时荧光定量PCR测定时，attI和attC位点之间间隔DNA序列非440bp，则为发生了整合作用，否则未发生整合作用；所述整合效率的数值大小表示整合酶活性大小。

2.根据权利要求1所述的耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法，其特征在于，S4中每升Tris-HCl、EDTA、甘油混合反应体系的配方为：20mmol Tris-HCl 100mmol NaCl、0.1 mmolEDTA、20ml质量浓度为1%的甘油，双蒸水定容至1L，反应体系的pH为7.5；反应条件：37℃，1小时，然后80℃，20min。