[发明专利]一种高通量筛选优质卵母细胞的方法

说明书

本发明提供了一种高通量筛选优质卵母细胞的方法，该方法首先通过成熟液Ⅰ和Ⅱ让卵母细胞在体外培养环境达到成熟，再通过脱卵丘溶液进行脱卵丘细胞，同时对卵母细胞的细胞膜结构的完整性进行初选，半透膜结构不完整的卵母细胞不会出现卵周隙，在此过程中可以淘汰一部分劣质卵母细胞；最后在等渗无激素溶液中复选，如果初选的卵母细胞的细胞膜不能恢复到脱卵丘溶液处理之前的状态，则这种卵母细胞也必须淘汰，从而可快速高通量筛选出优质卵母细胞，用于生产性克隆工作的开展。

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体而言，涉及一种通过渗透压处理技术高通量筛选优质卵母细胞的方法。

背景技术

目前，在核移植研究中，人们对所用的卵母细胞进行筛选的方法基本上只有如下两种：第一种是盲选，不管什么质量的卵母细胞，直接做；第二种是用亮甲酚蓝对卵母细胞染色，染上色的卵母细胞判断为质量较好的，未染上色的卵母细胞判断为质量不好的。文献检索披露：1.Theriogenology，68(2007)1299-1304作者：B.M.Manjunatha等，发表的《成熟前用亮甲酚蓝选择有发育潜力的水牛卵母细胞》文章内容是，将卵母细胞置于BCB染色液90分钟，比较了不同浓度BCB对卵母细胞的选择率；比较了经过选择的阴阳性卵母细胞直径的差别；比较了不同实验组(对照组，空白组，阳性组，阴性组)成熟率，囊胚率，结果阳性组高于其他组。2.Theriogenology，63(2005)2194-2205，作者：H.Alm等发表的《成熟前用可以检测G6PDH活性的亮甲酚蓝选择卵母细胞对牛体外囊胚发育率的影响》文章内容是，检测了经过BCB染色的阴、阳性卵母细胞在G6PDH活性上的差别，阴性组G6PDH活性高于阳性组和实验组。但阳性组体外成熟率、囊胚率高于其他组。3.Theriogenology，57(2002)1397-1409，作者：E.Rodriguez-Gonzalez等发表的《用亮甲酚蓝选择羔山羊卵母细胞》文章内容是，研究了不同浓度BCB染色液对羔山羊卵母细胞的选择，比较经过选择后的卵母细胞的体外受精率和成熟率，发现26μM浓度的染色液适合羔山羊卵母细胞的选择。经过选择后的阳性卵母细胞在细胞直径，体外发育率等方面都显著高于阴性卵母细胞。4.Theriogenology，61(2004)735-744，作者：MarcPujol等发表的《通过亮甲酚蓝(BCB)选择具有发育潜力的小母牛卵母细胞》文章内容是，研究了BCB染色液在用于体外胚胎生产的小母牛卵母细胞上的选择作用。比较了阳性卵母细胞与对照组以及成年母牛之间发育潜力、卵母细胞直径差异，结果表明：不同等级卵母细胞选择率不同，阳性卵母细胞直径大于阴性卵母细胞，阳性胚胎囊胚发育率高于阴性组和对照组，但低于成年母牛组。国内有关中国农业科学院北京畜牧兽医研究所乔利敏等8人发表的《亮甲酚蓝染色对牛卵母细胞体外成熟及体外受精的影响》也将亮甲酚蓝染色液用于牛卵母细胞的筛选等。显然，第二种方法需要在培养基中添加染料并进行90min的培养，该方法操作较为复杂，并且筛选效率低，不利于大量生产性克隆工作的开展。

发明内容

鉴于有技术的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单方便的高通量筛选优质卵母细胞的方法，用以解决目前卵母细胞筛选效率低的问题。

为了实现本发明的目的，发明人结合多年来的科研经验并不懈探索和努力，最终通过在胚胎操作过程中序贯使用不同渗透压溶液，使卵母细胞在体外培养环境快速达到成熟，同时利用细胞的半透膜对渗透压的反应来快速高通量筛选优质卵母细胞。具体地，本发明的技术方案概括如下：

一种高通量筛选优质卵母细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)将挑选的卵丘卵母细胞复合体移入成熟液Ⅰ中培养，所述的成熟液Ⅰ的组成为：TCM199+2.90～3.15mM葡萄糖+0.85～0.95mM丙酮酸钠+0.52～0.60mML-半胱氨酸+90～110IU/mL青霉素+90～110μg/mL的硫酸链霉素+9％～11％卵泡液+9～11IU/mL PMSG+9～11IU/mLhCG；