[发明专利]一种高通量筛选优质卵母细胞的方法有效
| 申请号： | 201810072343.7 | 申请日： | 2018-01-25 |
| 公开（公告）号： | CN108004204B | 公开（公告）日： | 2021-05-11 |
| 发明（设计）人： | 肖红卫;张立苹;华再东;任红艳;李莉;华文君;毕延震;刘西梅;郑新民;李会锋 | 申请（专利权）人： | 湖北省农业科学院畜牧兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N5/075 | 分类号： | C12N5/075 |
| 代理公司： | 北京精金石知识产权代理有限公司 11470 | 代理人： | 强红刚 |
| 地址： | 430064 湖北省武汉市*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 通量 筛选 优质 细胞 方法 | ||
1.一种高通量筛选优质卵母细胞的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）将挑选的卵丘卵母细胞复合体移入成熟液Ⅰ中培养，所述的成熟液Ⅰ的组成为：TCM199+ 2.90～3.15mM葡萄糖+ 0.85～0.95mM丙酮酸钠+ 0.52～0.60mM L-半胱氨酸+ 90～110IU/mL青霉素+ 90～110μg/mL的硫酸链霉素+ 9%～11%卵泡液+ 9～11IU/mL PMSG+ 9～11IU/mL hCG；
（2）将步骤（1）培养后的卵丘卵母细胞复合体移入成熟液Ⅱ中培养，所述的成熟液Ⅱ的组成为：TCM199+ 2.90～3.15mM葡萄糖+ 0.85～0.95mM丙酮酸钠+ 0.52～0.60mM L-半胱氨酸+ 90～110IU/mL青霉素+ 90～110μg/mL的硫酸链霉素+ 9%～11%卵泡液；
（3）将骤（2）培养的卵丘卵母细胞复合体移入脱卵丘溶液中，震荡处理0.5-2min，然后转移出现卵周隙的卵母细胞进行下一步操作，所述的脱卵丘溶液组成为：PVA-TL-Hepes+15～25mg/mL透明质酸酶+ 9～15mg甘露醇+ 0.15～0.30mg BSA；
（4）将骤（2）初选的卵母细胞移入等渗无激素溶液中洗涤，淘汰卵胞质膜不能恢复的卵母细胞，所述的等渗无激素溶液的组成为：TCM199+ 2.90～3.15mM葡萄糖+ 0.85～0.95mM丙酮酸钠+ 0.52～0.60mM L-半胱氨酸+ 90～110IU/mL青霉素+ 90～110μg/mL的硫酸链霉素+ 19%～11%卵泡液+ 7～9mg/mL Hepes；
步骤（3）处理后选出卵周隙宽度为4-6μm的卵母细胞进行下一步操作。
2.根据权利要求1所述高通量筛选优质卵母细胞的方法，其特征在于，步骤（1）和步骤（2）的培养条件为：5%CO2，饱和湿度，时间16-28h,温度38-39℃。
3.根据权利要求1所述高通量筛选优质卵母细胞的方法，其特征在于，步骤（1）中所述的成熟液Ⅰ的组成为：TCM199+ 3.05mM葡萄糖+ 0.91mM丙酮酸钠+ 0.57mM L-半胱氨酸+100IU/mL青霉素+ 100μg/mL的硫酸链霉素+ 10%卵泡液+ 10IU/mL PMSG+ 10IU/mL hCG。
4.根据权利要求1所述高通量筛选优质卵母细胞的方法，其特征在于，步骤（2）中所述的成熟液Ⅱ的组成为：TCM199+ 3.05mM葡萄糖+ 0.91mM丙酮酸钠+ 0.57mM L-半胱氨酸+100IU/mL青霉素+ 100μg/mL的硫酸链霉素+ 10%卵泡液。
5.根据权利要求1所述高通量筛选优质卵母细胞的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的脱卵丘溶液组成为：PVA-TL-Hepes+ 20mg/mL透明质酸酶+ 12mg甘露醇+ 0.2mg BSA。
6.根据权利要求1所述高通量筛选优质卵母细胞的方法，其特征在于，步骤（4）中所述的等渗无激素溶液的组成为：TCM199+ 3.05mM葡萄糖+ 0.91mM丙酮酸钠+ 0.57mM L-半胱氨酸+ 100IU/mL青霉素+ 100μg/mL的硫酸链霉素+ 10%卵泡液+ 7.5mg/mL Hepes。
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