[发明专利]一种嗜热杜邦菌α-淀粉酶的高效制备及其应用

说明书

本发明涉及一种嗜热杜邦菌α‑淀粉酶的高效制备方法及其应用。克隆嗜热杜邦菌α‑淀粉酶基因并在毕赤酵母中高效表达，经高密度发酵168h，上清液酶活力达到38314.2U/mL，蛋白含量为28.7mg/mL。所述酶的最适pH和最适温度分别为6.5和60℃，在pH 4.5‑10.0的范围内和55℃以下，酶活力保持稳定。所述酶对Ca²⁺没有依赖性，且具有一定的转糖苷活性。所述酶可用于生产麦芽糖含量为51.8％的麦芽糖浆；应用于馒头和面包中，能够增大比容，减小硬度。所述酶在食品行业具有很大的应用潜力。

技术领域

本发明涉及食品生物技术领域，具体说是一种嗜热杜邦菌α-淀粉酶的高效制备及其应用。

背景技术

α-淀粉酶能够从淀粉分子内部随机切断α-1,4糖苷键，其产物还原性末端葡萄糖残基上C1碳原子的构型为α-构型。α-淀粉酶在自然界中分布广泛，不仅可以作用于直链淀粉，还可作用于支链淀粉，因此广泛应用于食品、造纸、饲料等多个行业中。在淀粉糖生产中，常以淀粉为原料，将α-淀粉酶与普鲁兰酶等复配，生产葡萄糖、麦芽糖等淀粉糖；在烘焙过程中加入α-淀粉酶，可以提高面包体积，改善面包组织结构；在饲料工业中，通过添加α-淀粉酶可促进幼龄动物对淀粉的消化利用，同时发现在肉鸡饲料中添加一定量的α-淀粉酶，可提高肉鸡增重(丁皓,王冠,徐丽,等.α-淀粉酶的应用研究进展.饲料博览,2012,(08):12～14)。

大多天然微生物产α-淀粉酶，存在产酶活力低、酶系复杂等问题，随着基因工程技术的发展，构建工程菌株成为外源基因高效表达的有效途径。巴斯德毕赤酵母作为较完善的真核表达系统，目前，已有多种来源α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达。Wang等将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)来源α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达，经在5L发酵罐分批补料发酵168h，α-淀粉酶产量为8.3g/L，在50L发酵罐中，α-淀粉酶产量为12.2g/L(WANG J,LIY,LIU D,et al.Codon optimization significantly improves the expression levelofα-amylase gene from Bacillus licheniformis in Pichia pastoris.[J].BioMedResearch International,2015,2015:1-9)。Parashar等克隆来源于Bacillus acidicola和Geobacillus thermoleovorans嵌合的α-淀粉酶基因，成功表达于毕赤酵母，在7L发酵罐中发酵产α-淀粉酶，最终表达量为120mg/L(PARASHAR D,SATYANARAYANA T.Production ofchimeric acidicα-amylase by the recombinant Pichia pastoris and itsapplications[J].Frontiers in Microbiology,2017,8(493):1-10)。中国发明专利201210251847.8公开了一种生产α-淀粉酶的方法，克隆大麦、地衣芽孢杆菌和曲霉的α-淀粉酶基因，构建含有以上三种α-淀粉酶基因表达框架的毕赤酵母表达载体、酿酒酵母表达载体和枯草芽孢杆菌表达载体，并将载体转化至相应的宿主菌，筛选高产酶活菌株，得到反应温度和pH适用范围更广的α-淀粉酶。201510127009.3公开了一种产低温酸性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌及其基因工程菌的构建，克隆枯草芽孢杆菌基因组中的低温酸性α-淀粉酶基因，并转化至毕赤酵母，获得高产低温酸性α-淀粉酶的基因工程菌株。可以看出α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达具有很大发展潜力，但是目前关于嗜热真菌α-淀粉酶在毕赤酵母高效表达的报道较少，仅有Rhizomucor pusillus来源α-淀粉酶(HE Z,ZHANG L,MAO Y,etal.Cloning of a novel thermostable glucoamylase from thermophilic fungusRhizomucor pusillus and high-level co-expression withα-amylase in Pichiapastoris[J].BMC Biotechnology,2014,14(1):3-10)。