[发明专利]不同体积数字PCR定量分析方法

说明书

通过不同体积数字PCR的定量分析方法，可以获得的ln(c)相应的标准差σ以及置信区间。通过ln(c)相应的标准差σ以及置信区间可以得到待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，因此也可以获知所述待测核酸扩增反应液中含有的DNA起始拷贝数目。所述不同体积数字PCR的定量分析方法可以利用少于200个微液滴实现5个数量级的检测动态范围，提高了数字PCR检测仪器的检测动态范围。并且，其性能可以和拥有12000个微液滴的单一体积数字PCR相媲美，节省了仪器的成本，耗材成本降低。

技术领域

本发明涉及数字PCR定量分析领域，特别是涉及一种不同体积数字PCR定量分析方法。

背景技术

数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。但是，目前数字PCR定量检测无论是微孔式还是液滴式的数字PCR技术，采用的都是是单一体积数字PCR技术。

单一体积数字PCR的定量上限主要取决于反应单元的体积和数量，检测下限与样本总体积相关。单一体积数字PCR的定量分析方法需要连续对待测核酸扩增反应液进行稀释，增加了试剂的用量和交叉污染的风险，操作步骤繁琐。因此，单一体积数字PCR的定量分析方法缩小了数字PCR检测仪器的检测动态范围，从而无法提高检测灵敏度。

发明内容

基于此，有必要针对单一体积数字PCR的定量检测方法灵敏度低的问题，提供一种检测动态范围大的的不同体积数字PCR定量分析方法。

本发明提供一种不同体积数字PCR的定量分析方法，包括：

S4310：获取所有微液滴体积v₁，v₂，...v_m，所述体积为v₁，v₂，...v_m依次对应的微液滴的数目n₁，n₂，…，n_m，以及所述体积为v₁，v₂，...v_m依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微液滴数目b₁，b₂，…，b_m；

S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v₁、v₂，...v_m，n₁，n₂，…，n_m，b₁，b₂，…，b_m，构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；

S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；

S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；

S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述待测核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。

在其中一个实施例中，所述S4310包括：

S4311：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，获得多个不同体积v₁，v₂，...v_m的微液滴，所述微液滴体积为v₁，v₂，...v_m依次对应的微液滴的数目n₁，n₂，…，n_m；