[发明专利]一种生产蜂毒肽的方法

说明书

本发明提供了一种生产蜂毒肽的方法，具体利用发根农杆菌K599介导的大豆转基因技术生产蜂毒肽蛋白的方法，能够高效地表达蜂毒肽蛋白。同时，在目的蛋白中间使用蛋白酶切位点，保证了蜂毒肽不会杀死植物细胞，纯化后加入肠激酶后，蜂毒肽能够被切下来。此发明首次在大豆发根里面成功表达出蜂毒肽蛋白，较之前原核表达的蜂毒肽来说，其活性更强，可溶性更高，而且植物体内表达的蜂毒肽蛋白粗提取就可以用来做药，因为植物体内没有对人体有害的物质。

技术领域

本发明属于生物试剂发明领域，具体涉及一种生产蜂毒肽的方法。

背景技术

上世纪70年代，国外开始对蜂毒肽分子生物学研究，Kindas．Mugge等将从蜂王毒腺中提取的mRNA注入青蛙卵中，合成了蜂毒肽前体蛋白promeliain)。Vlasak等用质粒pBR322构建了蜂王毒腺cDNA文库，并以蜂王毒腺总mRNA制作探针进行杂交，获得了蜂毒肽的cDNA，而王关林等通过RT-PCR方法扩增得到了蜂毒肽前体蛋白的cDNA，测得序列长度为155bp，与Vlasak等发表的序列完全相同；另外再通过在蜂毒肽序列前引入羟胺裂解位点，以定点诱变的方式构建了诱变蛋白表达载体，该载体与β-半乳糖苷酶部分序列相融合，结果在大肠杆菌中成功地表达了诱变蛋白，为基因工程生产蜂毒肽提供了新途径。

但是，原核表达蜂毒肽有以下缺陷：（1）原核系统表达的真核生物蛋白质缺乏很多翻译后修饰，使得蜂毒肽的活性不如真核表达系统表达得多。（2）原核表达蜂毒肽为了避免蜂毒对细胞的毒害，通常会在其N端连入GST等标签蛋白从而表达为融合蛋白，这些融合蛋白的可溶性较差，也就是说具有生物活性的蜂毒肽的量非常少。（3）原核表达及真核酵母表达，在发酵的过程中，大肠杆菌及酵母体内会产生大量的内毒素，在纯化蜂毒肽的过程中，需要花费大量的成本去除对人体有害的细胞内毒素。

目前植物表达蜂毒肽的瓶颈在于蜂毒肽会使得细胞膜受到破坏，直接表达会造成工程菌、转基因植物的的细胞膜遭到破坏导致死亡。

密码子的选择和融合蛋白的选择也会对植物的表达蜂毒肽造成影响。因此我们根据植物的表达偏好，在保持蜂毒肽氨基酸序列保持不变的条件下，更改了一些氨基酸的密码子，使得蜂毒肽能够在植物当中正常表达。

另外我们在构建表达载体的过程中选择了保留蜂毒肽的内含子，这样可以保证蜂毒肽在克隆所用的工程大肠杆菌（DH5α）中不会导致工程菌的死亡。我们选择了截短的萤火虫荧光素酶（Nano Firefly Luciferase）作为与蜂毒肽融合表达的报告蛋白，该蛋白只有在有底物作用下发出荧光的特性，不仅能够抑制蜂毒肽的活性，并且能够方便地检测到蜂毒肽融合蛋白的表达。接着我们用羟胺裂解酶识别位点作为蛋白linker连接萤火虫荧光素酶与蜂毒肽。

发明内容

本发明的目的在于提供一种生产蜂毒肽的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种生产蜂毒肽的方法，包括载体设计以及构建、电击转化K599农杆菌感受态、大豆的培养与侵染、蛋白纯化。