[发明专利]一种生产蜂毒肽的方法

权利要求书

1.一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述方法包括载体设计以及构建、电击转化K599农杆菌感受态、大豆的培养与侵染、蛋白纯化。

2.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的载体设计以及构建为：设计引物Egfp F：5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg，

Egfp R：5’-3’ CTTGTCGTCGTCGTCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC，

millitin F：5’-3’ ggacgacgacgacaagggaattggagcagttctgaa，

millitin R：5’-3’ GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC，

首先各自以Pci Egfp载体和合成的PCI millitin为模板扩增出来egfp和millitin，然后利用Egfp F：5’-3’ cattctggcgggatccatggtgagcaagggcgagg和millitin R：5’-3’GAGAAAGCTTGGATCCTTAACCCTGTTGCCTCTTAC引物进行重叠 pcr，将egfp和millitin扩增到一起，回收后和限制性内切酶BamHI线性化的Pcambia 3301载体连接，转化DH5a，菌落pcr验证大小正确的克隆送测序，测序正确的单菌落提取Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒并保菌。

3.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的电击转化K599农杆菌感受态为将1微克Pcambia 3301 nanoluc gfp millitin质粒和100微升K599感受态细胞混匀，然后1800V电击转化6ms，加入600微升LB液体培养基，220rpm 28℃孵育1h，4000rpm离心5min后，涂50ug/ml卡那霉素抗性的LB固体培养基平板，两天后挑取单克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的菌落保菌。

4.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的大豆的培养与侵染为：将培养好的大豆子叶剪下来，用70%酒精表面消毒，并在子叶背部用刀片切掉1-2cm长的棱，将其平铺到培养皿里面，培养皿里面垫一层灭过的滤纸，并且加入5ml的双蒸水；与此同时，将前一步骤中获得的K599农杆菌提前一晚上摇起来，至OD600为1.2，然后用10mM的MgSO₄溶液调至OD600为0.35，吸取20微升用枪头打到子叶切口处，然后盖上培养皿盖子，封口膜封住，置于75 mmol*m⁻²*s⁻¹ 光强16h光照/8h黑暗培养，15d后，看到伤口处有明显的根长出来，此时将培养皿转入全日照下，长大7d后，将根剪下来，进行蛋白检测。

5.根据权利要求1所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：蛋白纯化为：将剪下来的发根冻入液氮，并在研钵内研磨，随后加入植物裂解液，1克样品需要1ml裂解；4℃垂直混匀20min，然后14000g 4℃高速离心10min，吸取上清液，加入30μLGFP beas，垂直混匀4h，800g离心5min，然后加入1ml wash buffer，垂直混匀5min，反复洗5次，然后加入50μLPBS和15μL肠激酶，37℃过夜孵育，800g离心5min，吸取上清液后，超滤，得到蜂毒肽蛋白。

6.根据权利要求5所述的一种生产蜂毒肽的方法，其特征在于：所述的植物裂解液含20mM pH 7.5 HEPES，40mM KCl，1mM EDTA，1% Triton X-100，1mM PMSF；所述wash buffer含20 mM pH 7.5 HEPES，40mM KCl，1mM EDTA， 0.1% Triton X-100。