[发明专利]基于分子标签和二代测序降低测序错误的测序方法、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种基于分子标签和二代测序降低测序错误的测序方法、试剂盒以及其应用，测序方法包括：S1.针对每个样本合成4‑16种含有不同固定特异序列标签的接头的正链P5和反链P7，将P5和P7退火，形成Y字型接头；S2.将模板DNA末端补平，并在3’端添加A碱基；S3.将Y字型接头连接到处理后的模板DNA两端；S4.回收连接上接头的模板DNA，并用带有样本标签的接头引物对模板DNA进行富集扩增；S5.回收经富集扩增的产物；S6.对富集扩增产物进行二代测序。本发明方法可有效识别双链DNA原始模板中的突变，尤其是不对称突变,因而可有效识别从第一次富集扩增开始引入的扩增错误,在Illumina单端和双端样本标签测序模式下，通过样本独有的4‑16种接头的固定特异序列，可有效解决样本标签漂移问题。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于分子标签和二代测序降低测序错误的测序方法、试剂盒及其应用。

背景技术

二代测序通过文库构建，对目标DNA模板连接上接头序列，并通过富集扩增获得更多的目标DNA模板，然后将构建好的文库在二代测序平台进行深度测序。

以上测序平台的文库构建及平台测序时都使用DNA聚合酶，为保证检测的准确性，均使用高保真DNA聚合酶，该类DNA聚合酶的保真性高于10^-9，即每合成10⁹个碱基时会随机出现1个碱基的错误。因此，该技术的测序错误约0.1％。

因此，在使用以上技术进行低频碱基变异相关产品测序时，受到测序错误的影响无法有效识别真实低频突变信息。例如，肿瘤液体活检需要检测千分之一甚至万分之一的低频突变；微生物多样性的测序分析需要对种群丰度达到几千甚至上万的样品进行种群多样性分析或功能基因的多样性进行分析，需要分辨千分之一甚至万分之一的碱基差异。在技术测序错误达到0.1％时，真实突变被淹没在测序错误的假突变中而无法识别。

为降低测序错误，Swift Biosciences公司提供了解决方案，即Accel-NGS 2SIndexed Adapters。在文库构建时，在接头的P5端标签位置添加9个碱基的随机序列做标签，对原始模板的正链和负链分别进行标记。在对二代测序结果进行分析时，可以通过以上9个碱基的序列将原始模板的正链和负链分别识别出来，将重复序列进行合并，同时彼此校验。在原始模板上由富集扩增和测序带来的错误可以检测出来并矫正，以此降低测序错误。

同时，IDT公司也提供了解决方案，即Dual Index UMI Adapters。在文库构建时，在接头的P7端标签前另外增加9个碱基的随机序列做标签，对原始模板的正链和负链分别进行标记。在对二代测序结果进行分析时，可以通过以上9个碱基的序列将原始模板的正链和负链分别识别出来，将重复序列进行合并，同时彼此校验。在原始模板上由富集扩增和测序带来的错误可以检测出来并矫正，以此降低测序错误。

以上技术通过在接头的P5或P7的标签位置添加9个碱基的随机序列来降低测序错误，但由于来自同一条双链DNA的原始模板的正链和负链带有不同的标签，且该标签组合不确定，因此，无法将来自同一条双链DNA原始模板的正链和负链一一匹配的还原。因此，无法识别双链DNA原始模板中的不对称突变。

同时，在连接带有标签的接头后的富集扩增的第一轮扩增时，由于DNA聚合酶存在10e-9的扩增错误，该错误会造成该正链/负链原始模板的扩增产物存在不对称突变，在用P5或P7的标签位置的9个碱基的随机序列来降低测序错误时，正链/负链在错误位置会有2中碱基，无法有效分辨对错。

在Illumina测序平台进行二代测序时，若同时进行多个样本，则会发生样本标签序列漂移问题，即，1号样本的样本标签错误的变成了2号或其它样本的标签，造成其他样本中错误的带有了不属于它的序列，因此，会错误的引入的突变信息。Swift Biosciences公司和IDT公司的方法为双端样本标签，在双端样本标签测序模式下，可以有效的矫正样本标签漂移，但在单端样本标签测序模式下，则无法解决该问题。

发明内容