[发明专利]基于分子标签和二代测序降低测序错误的测序方法、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种基于分子标签和二代测序降低测序错误的测序方法，其特征在于，所述测序方法包括如下步骤：

S1.针对不同样本，合成4-16种含有不同固定特异序列标签的接头的正链P5和反链P7，将各种接头的P5和P7进行退火，形成4-16种Y字型接头；

S2.将模板DNA进行末端补平，并在补平后的3’端添加A碱基；

S3.将4-16种Y字型接头连接到步骤S2处理后的模板DNA的两端；

S4.回收连接上接头的模板DNA，并用带有样本标签的接头引物对回收的模板DNA进行富集扩增；

S5.回收经步骤S4富集扩增的产物；

S6.对富集扩增产物进行二代测序。

2.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述固定特异序列标签位于P5的3’端，所述固定特异序列标签的反向互补序列位于P7的5’端。

3.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，所述4-16种含有不同固定特异序列标签的接头是等分子浓度混合，其中，所述固定特异序列标签由2-10个碱基组成。

4.根据权利要求1所述的测序方法，其特征在于，每个样本含有特定的4-16种不同固定特意序列标签，各个样本间的固定特意序列标签是不同的。

5.根据权利要求2所述的测序方法，其特征在于，P5为如SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸序列，所述P7为如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4中带有样本标签的接头引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物为如SEQ ID NO.3所示的脱氧核苷酸序列，所述反向引物为如SEQ ID NO.4所示的脱氧核苷酸序列。

7.一种实现如权利要求1-6任一项所述的测序方法的试剂盒，其特征在于，包括接头、接头连接试剂、扩增连接产物的接头引物、核酸富集磁珠。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述接头为P5序列和P7序列退火形成，所述P5为如SEQ ID NO.1所示的脱氧核苷酸序列，所述P7为如SEQ ID NO.2所示的脱氧核苷酸序列。

9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，扩增连接产物的接头引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物为如SEQ ID NO.3所示的脱氧核苷酸序列，所述反向引物为如SEQ ID NO.4所示的脱氧核苷酸序列。

10.如权利要求1-6中任一项所述的测序方法的应用，其特征在于，所述测序方法可单独或者与探针捕获技术结合应用于基因突变检测，或者应用于微生物多样性测序、种群多样性分析或功能基因的多样性分析。